Abstract
An integral part of preclinical pharmacokinetic studies is the development of a bioanalytical method for determination of the drug in a biological fluid.The aim of the research was to assess the suitability of the test system based on enzyme-linked immunosorbent assay (ELISA) for quantitative determination of rituximab in the blood serum of laboratory animals after intravenous administration of rituximab at a dose corresponding to the therapeutic dose in humans. Th test system was developed by the Scientific and Production Center Probiotech.Materials and methods: the determination of rituximab in biological samples was carried out using a two-stage sandwich-type ELISA, followed by detection based on horseradish peroxidase. The ELISA results were recorded using a microplate photometer at a wavelength of 450 nm.Results: the experiments helped to establish the detection limit (0.24 ng/mL) and the lower limit of quantitation (1.00 ng/mL) of rituximab in rabbit blood serum, they also demonstrated high selectivity of analyte determination in a multicomponent biological matrix. The mean rituximab concentration was within 14 % of the nominal value in the entire working range of the method. The within-run and between-run precision of the assay did not exceed 7.4 %, the total error of the method did not exceed 20.1 %. The linearity of dilution makes it possible to use the assay for the analysis of biological samples with a wide range of rituximab concentrations. The stability of the analyte in the rabbit blood serum was confirmed by storing samples for 6 hours at room temperature, for 50 days at —35 °C, and after 3 freeze-thaw cycles. The validated immunoassay was successfully used to determine the rituximab concentration in biological samples obtained in the rituximab pharmacokinetic trial in rabbits. The accuracy of the results was confirmed for the entire range of the determined concentrations; parallelism was demonstrated between the calibration curve and the results of analysis of serially diluted rabbit serum samples with the maximum concentration of rituximab.Conclusions: the proposed enzyme immunoassay test system can be used for quantitative determination of rituximab in the blood serum of laboratory animals, as it meets acceptance criteria for all validation parameters described in the international guidelines on validation of bioanalytical methods.
Highlights
Высокая стоимость оригинального препарата ритуксимаба создает острую потребность в его более доступных биоаналогах
Внутри аналитической серии (1 серия, 3 повтора для каждого образца) Within analytical run (1 run, each sample in 3 replicates)
Между аналитическими сериями (6 серий, 3 повтора для каждого образца) Between analytical runs (6 runs, each sample in 3 replicates)
Summary
ИФА тест-система для определения ритуксимаба в сыворотке крови (ООО «Научно-производственный центр Пробиотек») включала 96-луночный полистирольный планшет с иммобилизованными на поверхности лунок идиотипическими крысиными моноклональными антителами против ритуксимаба (клон MB2A4, Bio-Rad Laboratories, Inc., США), стандартный раствор ритуксимаба c концентрацией 10 мг/мл (приготовленный на основе препарата Мабтера® концентрат для приготовления раствора для инфузий 500 мг/50 мл («Рош Диагностикс ГмбХ», Германия)), раствор конъюгата козьих поликлональных антител против Fc фрагмента IgG человека с пероксидазой хрена (A0170, SigmaAldrich, США), субстратный раствор 3,3 ́,5,5 ́-тетраметилбензидина (ТМБ), стоп-реагент, а также отмывочный буферный раствор (0,01 М фосфатносолевой буфер с 0,05 % Твин-20) и реакционный буферный раствор (0,01 М фосфатно-солевой буфер с 1 % бычьего сывороточного альбумина). В составе каждой аналитической серии были проанализированы калибровочные стандарты для построения градуировочной зависимости, а также необходимое количество бланковых (интактных) образцов сыворотки крови кроликов и образцов для контроля качества с определенной концентрацией ритуксимаба. На первой стадии анализа в лунки планшета помещали 100 мкл калибровочного стандарта, образца для контроля качества, бланкового образца сыворотки крови или образца сыворотки кролика с неизвестной концентрацией ритуксимаба с предварительным разведением реакционным буферным раствором в требуемое количество раз. На второй стадии в каждую лунку планшета вносили 100 мкл рабочего раствора конъюгата и инкубировали в течение 30 мин, после чего планшет снова отмывали трижды отмывочным раствором (300 мкл/лунку). Предел обнаружения определялся как значение концентрации ритуксимаба, соответствующее среднему значению бланкового образца матрицы + 3SD. Нижний предел количественного определения рассчитывался как значение концентрации ритуксимаба, соответствующее среднему значению бланкового образца матрицы + 10SD
Sign-in/Register to view highlights & summary 
Published Version (
Free)
Talk to us
Join us for a 30 min session where you can share your feedback and ask us any queries you have
Schedule a call