Annona mucosa é uma árvore frutífera da família Annonaceae, produtora de importantes metabólitos secundários de interesse medicinal, como lignanas, acetogeninas e alcaloides. A cultura in vitro de calos representa um importante recurso para a produção contínua de metabólitos, viabilizando a conservação da biodiversidade química e a obtenção controlada de material para estudos biológicos e fitoquímicos. O objetivo deste trabalho foi otimizar a produção de calos friáveis de A. mucosa, avaliando o efeito de diferentes meios nutritivos e fitorreguladores. Segmentos de folha e de hipocótilo de plântulas germinadas in vivo foram utilizados como explantes e inoculados nos meios de cultura MS, WPM e B5 suplementados com picloram (2 - 20µM) isolado ou combinado com as citocininas BAP, KIN ou TDZ (0,2 - 1µM). As culturas foram mantidas a 26±2ºC, no escuro, com subcultivos mensais. A produção de calos foi avaliada por aferição do peso dos calos, após 90 dias. Em todos os tratamentos na presença da auxina picloram, o cultivo de hipocótilos resultou em maior porcentagem de formação de calos, sobretudo no meio de cultura WPM. A associação com TDZ produziu massa calogênica friável altamente proliferativa e ausente de oxidação, alcançando valores superiores àqueles obtidos em trabalhos prévios com a espécie. Os resultados viabilizam o uso do material em suspensões celulares e posterior caracterização fitoquímica para a exploração da produção in vitro de metabólitos da espécie.