O presente trabalho teve por objetivo identificar as espécies medicinais nativas em um fragmento de mata situada na Fazenda Azulão, em Dourados/MS, baseando-se no conhecimento popular de mateiros da região, com intuito de gerar subsídios para perpetuar a preservação, a diversidade e variabilidade das espécies, bem como, incentivar populações locais a valorizar e preservar esses recursos naturais, retardando o impacto sobre a biodiversidade. Partes das plantas indicadas como medicinais foram coletadas, as quais foram identificadas mediante literaturas especializadas e por comparações com plantas depositadas no Herbário da Cidade Universitária de Dourados. Foram identificadas 61 espécies distribuídas em 35 famílias e 53 gêneros. As famílias Asteraceae (9), Fabaceae (5) e Piperaceae (4) foram as que apresentaram o maior número de espécies. Dentre as formas de vida encontradas na vegetação nativa do local, as espécies medicinais de hábito arbustivo (39,34%) foram as que apresentaram os maiores valores, seguido pelas herbáceas (27,86%), arbóreas (24,6%), e lianas (8,2%). As partes das plantas mais utilizadas são as folhas, seguidas da raiz e casca. Com base nos resultados obtidos nesse estudo, as indicações da utilização das plantas medicinais podem fornecer subsídios para estudos bioquímicos e farmacológicos, diminuindo os custos e o tempo na extração de princípios ativos, bem como, permitir o fortalecimento do conhecimento cultural da comunidade local, incentivando a preservação ambiental de diversas espécies medicinais utilizadas na região. Novos estudos devem ser conduzidos no Estado do Mato Grosso do Sul, a fim de se garantir o registro de dados mais precisos sobre as espécies medicinais ocorrentes.