The Lake Eacham rainbowfish (Melanotaenia eachamensis) was declared extinct in the wild in the late 1980s after it disappeared from its only known locality, an isolated crater lake in northeast Queensland. Doubts have been raised about whether this taxon is distinct from surrounding populations of the eastern rainbowfish (Melanotaenia splendida splendida). We examined the evolutionary distinctiveness of M. eachamensis, obtained from captive stocks, relative to M. s. splendida through analysis of variation in mtDNA sequences, nuclear microsatellites, and morphometric characters. Captive M. eachamensis had mtDNAs that were highly divergent from those in most populations of M. s. splendida. A broader geographic survey using RFLPs revealed some populations, initially identified as M. s. splendida, that carried eachamensis mtDNA, whereas some others had mixtures of eachamensis and splendida mtDNA. The presence of eachamensis‐like mtDNA in these populations could in principle be due to (1) sorting of ancestral polymorphisms, (2) introgression of M. eachamensis mtDNA into M. s. splendida, or (3) incorrect species boundaries, such that some populations currently assigned to M. s. splendida are M. eachamensis or are mixtures of the two species. These alternative hypotheses were evaluated through comparisons of four nuclear microsatellite loci and morphometrics and meristics. In analyses of both data sets, populations of M. s. splendida with eachamensis mtDNA were more similar to captive M. eachamensis than to M. s. splendida with splendida mtDNA, supporting hypothesis 3. These results are significant for the management of M. eachamensis in several respects. First, the combined molecular and morphological evidence indicates that M. eachamensis is a distinct species and a discrete evolutionarily significant unit worthy of conservation effort. Second, it appears that the species boundary between M. eachamensis and M. s. splendida has been misdiagnosed, such that there are extant populations on the Atherton Tableland as well as areas where both forms coexist. Accordingly, we suggest that M. eachamensis be listed as vulnerable, rather than critical (or extinct in the wild). Third, the discovery of extant but genetically divergent populations of M. eachamensis on the Atherton Tableland broadens the options for future reintroductions to Lake Eacham.Distintividad Evolutiva y Estatus del Amenazado Pez Arcoíris (Melanotaenia eachamensis) del lago EachamEl pez acoíris del lago Eacham (Melanotaenia eachamensis) fue declarado extinto de poblaciones silvestres a finales de los 80’s después de su desaparición de la única localidad conocida, un cráter aislado en el noreste de Queensland. Se han incrementado las dudas acerca de si este taxón es distinto de las poblaciones circunvecinas del pez arcoiris del este (Melanotaenia spendida splendida). Examinamos la difernciación evolutiva de M. eachamensis, obtenida de stocks cautivos, en relación con M. s. splendida mediante un análisis de variación en secuencias de ADNmt, nuclear, microsatélites y caracteres morfométricos. M. eachamensis cautivos tuvieron ADNmt que difirió grandemente de aquellos provenientes de la mayoría de las poblaciones de M. s. splendida. Un estudio geográfico mas amplio usando RFLPs reveló que algunas poblaciones inicialmente identificados como M. s. splendida, contenían ADNmt de eachamensis, mientras que otros presentaron mezclas de DNAmt de eachamensis y splendida. La presencia de DNAmt del tipo de eachamensis en estas poblaciones, podría en principio, deberse a 1) una forma de polimorfismos ancestrales, 2) Introgresión del ADNmt de M. eachamensis hacia M. s. splendida o 3) límites incorrectos para las especies, tal como que algunas poblaciones actualmente asignadas al ADNmt de M. s. splendida son M. eachamensis o son una mezcla de las dos especies. Estas hipótesis alternativas fueron evaluadas mediante comparaciones de cuatro loci microsatélites nucleares y datos morfométricos y merísticos. En el análisis de ambas bases de datos, las poblaciones de M. s. splendida con DNAmt de M. eachamensis fueron mas similares a M. eachamensis cautivos que a M. s. splendida con ADNmt de splendida, esto soporta la hipótesis 3. Estos resultados son significativos para el manejo de M. eachamensis en diversos aspectos. Primero, las evidencias moleculares y morfológicas indican que M. eachamensis es una especie distintiva y una unidad evolutiva significante, lo suficientemente valiosa como para un esfuerzo conservacionista. Segundo, si parece que los limites de especies entre M. eachamensis y M. s. splendida han sido mal diagnosticados, a tal grado que hay poblaciones existentes en el altiplano de Atherton, asi como en áreas donde ambas formas coexisten. De acuerdo con esto, sugerimos que M. eachamensis debe ser enlistada como vulnerable, en lugar de crítica (o extinta). Tercero, el descubrimiento de poblaciones existentes, pero genéricamente divergentes de M. eachamensis en el altiplano de Atherton amplía las opciones para futuras reintroducciones en el lago Eacham. X775047