A β-galactosidase é uma enzima importante que atua na hidrólise da lactose, podendo ser empregada na obtenção de alimentos destinados a consumidores intolerantes a esse dissacarídeo. A levedura Kluyveromyces marxianus apresenta bom rendimento de crescimento, além de ser um micro-organismo seguro em aplicações industriais, e tem sido utilizada para produção da enzima por cultivo submerso. A β-galactosidase obtida foi fracionada com sulfato de amônio e caracterizada quanto a temperatura e pH ótimos, estabilidade térmica, valores D e z, e parâmetros cinéticos e termodinâmicos. A temperatura e pH ótimos foram de 45-50 °C e 7,0, respectivamente. A energia de ativação da reação enzimática foi de 9,8 kcal.mol-1 e da reação de desativação, 64,2 kcal.mol-1. Os valores de Km e Vmax obtidos foram de 3,7 mM e 99,0 U.mL-1, respectivamente. A energia livre de Gibbs reduziu com o aumento de temperatura, sendo a enzima mais estável a 30 °C (∆G* = 106,8 kJ.mol-1). A entalpia foi de 313,04 kJ.mol-1 e a entropia 0,68 kJ.mol-1.k-1. O valor D confirmou que a enzima foi mais estável em temperaturas próximas de 30 °C (D = 11.513,0 min) e o valor z foi de 5,8 °C.