Typing infectious bronchitis virus strains using reverse transcription-polymerase chain reaction and restriction fragment length polymorphism analysis to compare the 3′ 7.5 kb of their genomes

Abstract

Typing infectious bronchitis virus (IBV) strains is useful for implementation of control measures and for understanding the epidemiology and evolution of IBV. The aim of the work reported here was to develop a rapid and sensitive method for typing isolates of IBV, if possible directly from tissues of infected birds. A procedure was developed for differentiation of IBV strains by restriction endonuclease fragment length polymorphism (RFLP) analysis of a 7.5 kb DNA fragment amplified from their genome by reverse transcription-polymerase chain reaction (RT-PCR). This fragment encompassed all of the genes encoding the structural proteins of the virus. Viral RNA was extracted either directly from tissues of diseased birds or from virus propagated in embryonated eggs, and was subjected to RT-PCR. Three different restriction endonucleases, AluI, Sau3AI and MnlI, were used to digest the 7.5 kb PCR product from different IBV strains and the resultant RFLP patterns were compared. Patterns obtained with all three enzymes grouped IBV strains belonging to the same serotype in the same cluster. These results show that the RT-PCR–RFLP system described here can be used as a quick and inexpensive tool for differentiating IBV strains. Typage des souches de virus de la bronchite infectieuse en utilisant la transcription inverse et l'amplification en chaîne par polymérase ainsi que l'analyse du polymorphisme de taille des fragments de restriction pour comparer les fragments de 7,5 kb de leurs génomes en 3′ Le typage des souches de virus de la bronchite infectieuse (IBV) est utile pour l'exécution des mesures de contrôle et pour la compréhension de l'épidémiologie et de l'évolution des IBV. Le but de ce travail a été de développer une méthode rapide et sensible pour le typage des isolats d'IBV, si possible directement à partir des tissus des animaux infectés. Une procédure a été développée pour la différenciation des souches d'IBV par l'analyse du polymorphisme de taille des fragments de restriction (RFLP) d'un fragment d'ADN de 7,5 kb amplifié à partir de leur génome en utilisant la transcription inverse et l'amplification en chaîne par polymérase (RT-PCR). Ce fragment contient tous les gènes codant les protéines structurales du virus. L'ARN viral a été extrait soit directement des tissus des animaux malades, soit à partir du virus multiplié sur œufs embryonnés et soumis à la RT-PCR. Trois endonucléases de restriction, AluI, Sau3AI et MnlI, ont été utilisées pour digérer le produit de PCR de 7,5 kb des différentes souches d'IBV et les profils RFPL obtenus ont été comparés. Ainsi, avec les trois enzymes, il a été mis en évidence que les souches appartenaient au même sérotype du même groupe. Ces résultats montrent que le système RT-PCR-RFLP décrit ici peut être utilisé comme un outil rapide et bon marché pour la différenciation des souches d'IBV. Typisierung von Stämmen des infektiösen Bronchitisvirus mittels Reverse Transkriptase-Polymerasekettenreaktion und Restriktionsfragmentlängen-polymorphismusanalyse zum Vergleich der 3‘7,5 kb ihrer Genome Die Typisierung von Stämmen des infektiösen Bronchitisvirus (IBV) ist wichtig für die Durchführung von Bekämpfungsmaßnahmen sowie für das Vertändnis der Epidemiologie und Evolution von IBV. Das Ziel der hier beschriebenen Arbeit war es, eine schnelle und sensitive Methode für die Typisierung von IBV-Isolaten möglichst direkt aus dem Gewebe infizierter Tiere zu entwickeln. Es wurde ein Verfahren etabliert für die Differenzierung von IBV-Stämmen mittels Restriktionsendonukleasefragmentlängenpolymorphismus (RFLP)-Analyse eines 7,5 kb-DNS-Fragments, das aus dem Genom durch Reverse Transkriptase-Polymerasekettenreaktion (RT-PCR) amplifiziert worden war. Dieses Fragment umfasste alle Gene, die für die Strukturproteine des Virus kodierten. Die virale RNS wurde entweder direkt aus dem Gewebe erkrankter Tiere oder aus im embryonierten Hühnerei angezüchtetem Virus extrahiert und der RT-PCR unterzogen. Drei verschiedene Restriktionsendonukleasen, AluI Sau3AI und MnlI, wurden für die Verdauung der 7,5 kB-PCR-Produkte aus den verschiedenen IBV-Stämmen verwendet und die resultierenden RFLP-Muster wurden verglichen. Die mit allen drei Enzymen erhaltenen Muster führten zur Eingruppierung von IBV-Stämmen, die zu dem gleichen Serotyp gehörten, in das gleiche Cluster. Diese Ergebnisse zeigen, dass das hier beschriebene RT-PCR-RFLP-System als schnelle und kostengünstige Methode zur Differenzierung von IBV-Stämmen verwendet werden kann. Tipificación de cepas de virus de bronquitis infecciosa mediante transcriptasa reversa-reacción en cadena de la polimerasa y análisis del polimorfismo de la longitud de los fragmentos de restricción para comparar los 3’ 7.5 kb de sus genomas La tipificación de las cepas de virus de bronquitis infecciosa (IBV) es útil para la implementación de medidas de control y para entender la epidemiología y la evolución de IBV. El objetivo del presente trabajo es desarrollar un método rápido y sensible para tipificar aislados de IBV, si es posible directamente de tejidos provenientes de aves infectadas. Se desarrolló un procedimiento para diferenciar las cepas de IBV mediante análisis del polimorfismo de la longitud de los fragmentos de restricción (RFLP) de un fragmento de ADN de 7.5 kb amplificado de su genoma con una técnica de transcriptasa reversa-reacción en cadena de la polimerasa (RT-PCR). Este fragmento contenía todos los genes que codificaban para las proteínas estructurales del virus. El ARN vírico fue extraído directamente de tejidos de aves enfermas, o de virus propagado en huevos embrionados mediante la RT-PCR. Se utilizaron tres endonucleasas de restricción AluI, Sau3AI y MnlI, para digerir el producto de PCR de 7.5 kb de diferentes cepas de IBV y los patrones de RFLP resultantes fueron comparados. Los patrones obtenidos con los tres enzimas clasificaron las cepas de IBV pertenecientes al mismo serotipo en el mismo grupo. Estos resultados muestran que el sistema de RT-PCR-RFLP descrito puede ser utilizado como una herramienta rápida y barata de diferenciar cepas de IBV.