Rat myocardial protein kinases: I. Cytosol

Abstract

Two groups of protein kinases have been obtained from rat heart cells by adjusting cytosol to pH 4.8. The cytosol proteins which remained soluble at this pH were fractionated by DEAE cellulose chromatography using a discontinuous phosphate buffer concentration. Three protein peaks, S I , S II and S III , contained protein kinase activity. The cytosol proteins which precipitated at pH 4.8 were separated by DEAE cellulose chromatography using a continuous NaCl linear gradient and found to contain two protein kinases, P I and P II . Histone F I was efficiently phosphorylated by S I , S II and S III enzymes. Cyclic AMP stimulated the kinase activities up to 10 fold. Casein and phosvitin were not good substrates for the S enzymes and the effect of cAMP was not consistent. The P I enzyme phosphorylated histone, casein and phosvitin only poorly, P II phosphorylated histone, only poorly, casein was phosphorylated to a much greater extent ; phosvitin was the best substrate. None of the P enzymes was activated by cAMP. Na + ions up to a concentration of 20 mM stimulated the S enzymes in the presence of cAMP but had no effect on the P enzymes. Concentrations of K + ions higher than 20 mM inhibited the S enzymes but had no effect on the the P enzymes. Ca ++ had no effect on the cardiac protein kinases, but Mg ++ was an absolute requirement for the kinases. The effects of pH were different for all the protein kinases. PHMB inhibited the activity of the S enzymes ; this inhibition could be reversed by β mercaptoethanol. P II enzyme was not affected by PHMB or β mercaptoethanol. This, together with other data, strongly supports the suggestion that the myocardial cytosol kinases are distinct enzymes. The cardiac protein kinases were unable to phosphorylate myosin, tropomyosin, troponin and actin in the presence or in the absence of cAMP under our assay conditions. Deux groupes de protéines kinases ont été obtenus à partir du cœur de rat en amenant le cytosol à pH 4.8. Les protéines non précipitées à ce pH ont été fractionnées par chromatographie sur colonne de DEAE cellulose à l'aide d'un tampon phosphate en gradient discontinu de concentration. Trois pics avec une activité protéine kinase ont été obtenus : S I , S II et S III . Les protéines cytosoliques qui précipitent à pH 4,8 ont été fractionnées par chromatographie sur DEAE cellulose à l'aide d'un gradient de concentration continu de NaCl. Deux protéines kinases ont été obtenues, P I et P II . L'histone F 1 est fortement phosphorylée par les kinases S I , S II et S III . L'AMP cyclique active la phosphorylation jusqu'à 10 fois. La caséine et la phosvitine sont peu phosphorylées par ces enzymes et l'AMP cyclique a une activité faible et inconstante. L'enzyme P I phosphoryle faiblement l'histone, la caséine et la phosvitine. P II phosphoryle faiblement l'histone, et phosphoryle activement la caséine, cependant, la phosvitine est le meilleur substrat. Aucun des enzymes P n'est activé par l'AMP cyclique. L'ion Na + , à une concentration de 20 mM, stimule les enzymes S en présence d'AMP cyclique, mais a peu d'effet sur les enzymes P. L'ion K + , à une concentration supérieure à 20 mM, inhibe les enzymes S et a peu d'effet sur les enzymes P. L'ion Mg ++ est indispensable mais l'ion Ca ++ est sans effet sur les protéines kinases cardiaques. Le pH optimum est différent pour chaque enzyme. Le PHMB inhibe les enzymes S, l'inhibition est supprimée par le β mercaptoéthanol. L'enzyme P II n'est pas affecté par le PHMB. Ces résultats semblent montrer que les kinases étudiées sont des enzymes distincts. Les kinases cardiaques ne phosphorylent pas la myosine, la tropomyosine, la troponine et l'actine, aussi bien en absence qu'en présence d'AMP cyclique, dans nos conditions expérimentales.