螢光假單胞菌Pseudomonas putida YLFP14 Tn5誘導之無鞭毛突變菌株之特性分析及其鞭毛基因之選殖

Abstract

螢光假單胞菌 Pseudomonas putida YLFP14 可有效防治 Xanthomonas axonopodis pv. vesicatoria 與 X. vesicatoria 所引起的甜椒細菌性斑點病。為探討 P. putida YLFP14 之游動性，對此菌在葉片上群集能力及其對病害防治能力之影響，本研究自 Tn5 誘導之 P. putida YLFP14 突變菌株中，篩選出三株無鞭毛之突變菌株 J17、J80 及 J134。由南方雜合分析顯示此三株突變菌株皆為單一 Tn5 跳躍子插入所引起之突變。此些突變菌株於Luria-Bertani broth 培養五小時內與野生型 YLFP14 菌株之生長曲線相近，然在培養五小時後，其生長量明顯較野生型 YLFP14 菌株為高；於碳素源利用情形顯示野生型 YLFP14 菌株無法利用 inosine、uridine、α- ketobutyric acid、α- ketovaleric acid 及 2,3-butanediol ，然突變菌株 J17、J80 及 J134 則可利用上述五種碳素源；在 NA、KB 及 PDA 培養基平板上對植物病原細菌 X. axonopodis pv. vesicatoria XVT40 之拮抗能力與野生型 YLFP14 菌株未有差異。以 Inverted-PCR (I-PCR) 技術分析顯示突變菌株 J17、J80 及 J134 中跳躍子 Tn5 所插入之基因，分別為 flgA 基因（產物為FlgA 蛋白，flagellar basal body P-ring formation protein）、fliI 基因（產物為 FliI 蛋白，flagellum-specific ATP synthase）及 flgG 基因（產物為 FlgG 蛋白，flagellar basal-body rod protein）。將具表現綠色螢光蛋白 (green fluorescent protein) 能力之載體 pBREGFPexp 利用電轉型法導入無鞭毛突變菌株 J17、J80 及 J134 中，分別獲得能穩定表現綠色螢光蛋白之衍生菌株 J17EG、J80EG 及 J134EG，此三株具綠色螢光蛋白標記之衍生菌株之生長曲線、對95種碳素源利用情形與在 NA、KB 及 PDA 培養基平板上對植物病原細菌 X. axonopodis pv. vesicatoria XVT40 的拮抗能力，皆與J17、J80 及 J134 無差異。又本研究應用 PCR 及 I-PCR 技術自 P. putida YLFP14 基因體中進行鞭毛基因之選殖與分析。共選殖得到3645 bp 大小之 P. putida YLFP14 鞭毛相關基因片段，此基因片段包含三個完整之 ORFs 與一不完整之 ORF，經胺基酸序列比對結果顯示，此些 ORFs 分別與已發表之螢光假單胞菌之 3-oxoacyl-(acyl-carrier-protein) synthase III、flagellin fliC、flagellin FlaG 及 flagellar cap protein FliD 具同源性。