探討 Sigma 因子 RpoS 與 RpoN 在創傷弧菌 YJ016 致病過程中的調控機轉

Abstract

創傷弧菌（Vibrio vulnificus）是能經傷口及食物感染人體且具高度致死率的伺機性感染病源菌（opportunistic pathogen），主要造成原發型敗血症及傷口化膿潰爛。 創傷弧菌由海水入侵人體後，必須因應環境改變與宿主免疫壓力，表現特定致病基因以成功造成感染。 在調控致病相關基因表現的因子當中，sigma factors S（RpoS）是細菌抗壓反應的主要因子之一，而 sigma factor N（RpoN）對具鞭毛的細菌而言，是調控運動性表現的主要因子。 為深入了解 RpoS 及 RpoN 等 sigma 因子在創傷弧菌 YJ016 致病過程中的調控機轉，我們以同源重組（homologous recombination）技術建構 rpoS 缺失（YJΔS）、rpoN 缺失（YJΔN）及 rpoS/rpoN 雙重缺失（YJΔNS）的突變菌株。 YJΔS、YJΔN、YJΔNS 等突變株在不同培養條件下的生長能力與野生型 YJ016 間無顯著的差異，但 rpoS 基因缺失的 YJΔS 與 YJΔNS 突變株，無法在 TCBS 培養基上發酵蔗糖產酸，而且亦失去對血液培養基的溶血能力。 此外 YJΔS 在半固態培養基游走（swarming）的速度略快於 YJ016，在固態培養基表面顯現邊緣呈鋸齒狀的菌落，不同於野生型的圓滑邊緣。 西方墨點轉漬法與穿透式電子顯微鏡觀察的結果顯示 rpoN 基因缺乏使創傷弧菌因無法合成鞭毛結構蛋白 FlaA 而無鞭毛構造，導致 YJΔN 及 YJΔNS 突變株喪失游走能力，顯示 rpoN 基因在鞭毛合成上的重要性。 rpoS 基因的缺失，使 YJΔS 在 30℃ 的 LB 及 TCG 培養後的生物膜生成量，為其他菌株的 2 ~ 5 倍多，且完全喪失 caseinase 的活性。 以 MOI=10 菌量的不同創傷弧菌株感染人類大腸表皮細胞 Caco-2 細胞 2 小時發現 YJ016 有顯著細胞毒殺性，YJΔS 次之，而 YJΔN 及 YJΔNS 的毒殺能力明顯降低。 因為此種胞殺性需要細菌跟細胞直接接觸，所以缺失 rpoN 基因的突變菌株因失去鞭毛的運動能力使得菌落化 Caco-2 細胞的能力下降，而影響其細胞毒殺力。 皮下感染的小鼠動物模式中， rpoS 基因缺失使創傷弧菌在感染初期 24 小時內的毒力降低，YJΔS 的半致死菌量約為 YJ016 的 4 倍。 究竟 RpoS 與 RpoN 在創傷弧菌感染 Caco-2 細胞時扮演何種調控角色? RpoS 與 RpoN 對創傷弧菌游走能力的調控機制為何? 由於 RpoS 與 RpoN 在 E. coli 及 V. cholerae 內可調控許多不同基因的表達，我們將針對創傷弧菌運動相關與胞殺能力相關的基因，以蛋白質體學方法分析不同菌株間的蛋白表現圖譜，試圖勾勒 RpoS 與 RpoN 在創傷弧菌致病過程中之調控機轉。