Abstract
İnsülin
 pankreasın beta hücrelerinden üretilen ve vücutta glukoz dengesini sağlayan
 önemli bir peptit hormondur. Pankreasın yeterli miktarda insülin üretememesi ya
 da hücrelerin üretilen insüline cevap verememesi sonucu kan glukoz düzeyinin
 yükselmesiyle diyabet adı verilen metabolik bir hastalık meydana gelir.
 Günümüzde bu hastalığın tedavisinde insülin hormonu kullanılmaktadır. İnsülin
 hormonu genetik mühendisliği teknikleri kullanılarak rekombinant olarak
 üretilen ilk proteindir. İlk olarak Escherichia
 coli ve Saccharomyces cerevisiae’da üretilmeye başlanmış, ancak son zamanlarda rekombinant insülin üretiminde Pichia pastoris (Komagataella phaffi) ’in  kullanımı
 yaygınlaşmıştır. Bu çalışmada, insan insülin hormonu öncülerinin (IP) P. pastoris’in metanol ile
 indüklenebilir AOX1 promotoru altında
 üretimini sağlamak amacıyla; bu proteini kodlayan DNA fragmenti transformasyon
 ve ligasyon gibi moleküler biyoloji teknikleri kullanılarak plazmide aktarılarak
 istenen proteini kodlayan bir ekspresyon vektörü elde edilmiştir. Ekspresyon
 vektörünün lityum asetat yöntemiyle yetenekli hale getirilen P. pastoris X33 suşuna elektroporasyonla
 transferi sağlanmıştır. 5L ölçekli biyoreaktörde yapılan protein ekspresyonu
 çalışması sonrasında alınan örnekler SDS-PAGE ve ELISA yöntemleriyle analiz
 edilmiş ve 7.5 mg/L IP proteini üretildiği tespit edilmiştir.
Highlights
Insulin is a peptide hormone, produced by beta cells of the pancreas, and regulates the glucose homeostasis in the body
Diabetes mellitus is a metabolic disease in which a person has high blood sugar, either because the pancreas does not produce enough insulin, or because cells do not respond to produced insulin
Insulin is used to treatment of this disease
Summary
E. coli XL1-Blue ve P. pastoris suşları için besiyeri içerikleri Becton Dickinson (Franklin Lakes, NJ, ABD) firmasından temin edilmiştir. Restriksiyon enzimleri Fermentas (Fermentas, MD, ABD) ve Hot-start KOD DNA polimeraz enzimi Novagen (Darmstadt, Almanya) firmalarından alınmıştır. Test tüpüne ekilmiş ve 30 C’de çalkalamalı inkübatörde gece boyu gelişime bırakılmıştır. 8 ml lityum asetat karışımı (100 mM LiAc, 10 mM DTT, 0.6 M Sorbitol, 10 mM Tris-HCl pH 7.4) içinde süspanse edilmiş ve oda sıcaklığında 30 dakika inkübasyona bırakılmıştır. 4 C’de 3000xg hızında 5 dakika santrifüjlenerek tekrar hasat edilen hücreler 1.5 ml buz soğukluğundaki 1 M sorbitol içinde süspanse edilmiş ve 2 ml hacimli santrifüj tüpüne aktarılmıştır. 4 C’de 3000xg devirde 5 dakika santrifüjlenerek hasat edilen hücreler 3 kez 1.5 ml soğuk 1 M sorbitol ile yıkanmış, daha sonra son konsantrasyon 1010 hücre/ml olacak şekilde buz soğukluğundaki maya resüspansiyon tamponu (1 M sorbitol, %20 gliserol) içinde süspanse edilmiş, 80 l’lik sıvı bölüntüler halinde -80 C’de saklanmıştır 8 ml lityum asetat karışımı (100 mM LiAc, 10 mM DTT, 0.6 M Sorbitol, 10 mM Tris-HCl pH 7.4) içinde süspanse edilmiş ve oda sıcaklığında 30 dakika inkübasyona bırakılmıştır. 4 C’de 3000xg hızında 5 dakika santrifüjlenerek tekrar hasat edilen hücreler 1.5 ml buz soğukluğundaki 1 M sorbitol içinde süspanse edilmiş ve 2 ml hacimli santrifüj tüpüne aktarılmıştır. 4 C’de 3000xg devirde 5 dakika santrifüjlenerek hasat edilen hücreler 3 kez 1.5 ml soğuk 1 M sorbitol ile yıkanmış, daha sonra son konsantrasyon 1010 hücre/ml olacak şekilde buz soğukluğundaki maya resüspansiyon tamponu (1 M sorbitol, %20 gliserol) içinde süspanse edilmiş, 80 l’lik sıvı bölüntüler halinde -80 C’de saklanmıştır
Sign-in/Register to view highlights & summary Sign-in/Register to access full text options 
Talk to us
Join us for a 30 min session where you can share your feedback and ask us any queries you have
Schedule a callMore From: Süleyman Demirel Üniversitesi Fen Bilimleri Enstitüsü Dergisi
Disclaimer: All third-party content on this website/platform is and will remain the property of their respective owners and is provided on "as is" basis without any warranties, express or implied. Use of third-party content does not indicate any affiliation, sponsorship with or endorsement by them. Any references to third-party content is to identify the corresponding services and shall be considered fair use under The CopyrightLaw.
