Mutation of cystathionine beta-synthase gene (CBS G919A/T833C ) in patients with diabetic nephropathy detected by amplification refractory mutation system-real time PCR

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目的 建立胱硫醚-β-合成酶(CBS)基因T833C、G919A点突变的等位基因特异-荧光定量PCR(TaqMan-ARMS)测定方法,探讨2型糖尿病肾病患者CBS基因T833C、G919A点突变率及与糖尿病肾病(DN)的相互关系.方法 采用PCR时引物3'端错配扩增阻滞(ARMS)原理,结合荧光定量PCR技术(TaqMan探针),制备野生和突变质粒标准品,建立野生引物和突变引物2个反应体系,根据荧光定量PCR时野生引物循环阈值(Wct)与突变引物循环阈值(Mct)的比值△ct(△ct=Wct/Mct)及扩增有无指数增长期出现,建立点突变等位基因型的判定标准,并对94例DN患者(组1)和140例尿微量白蛋白正常的非糖尿病对照者(组2)的CBS基因T833C、G919A点突变进行检测.结果 建立的TaqMan-ARMS方法检测T833C野生等位基因型的判定标准为△ct＜0.72或Mct＞40,杂合突变型为0.9＜△ct＜1.10,纯合突变型为1.40＜△ct或Wct＞40;G919A野生等位基因型判定标准为△ct＜0.74或Mct＞40,杂合突变型为0.92＜△ct＜1.03,纯合突变型为1.26＜△ct或Wct＞40.T833C点突变TT、TC、CC 3种基因型在DN组分布频率分别为98.94%、1.06%和0,组2中分别是99.29%、0.71%和0;两组人群833C等位基因频率分别为0.53%和0.36%,基因型和等位基因频率差异均无统计学意义.各组中未发现G919A等位基因杂合突变和纯合突变型.结论 成功建立了测定CBS基因T833C、G919A点突变的TaqMan-ARMS方法,该方法准确、特异,适合高通量点突变的检测.本研究未观察到CBS基因T833C、G919A点突变为DN的遗传危险因素。