Molecular detection of Clavibacter michiganenis ssp. insidiosus in alfalfa seed

Abstract

Bacterial wilt of alfalfa (Medicago sativa), caused by Clavibacter michiganensis ssp. insidiosus (Cmi), is a serious disease that spreads to new production areas mainly by infected seed. Hence, detection of Cmi in seedlots is an important disease mitigation measure. A conventional polymerase chain reaction (PCR) assay targeting the internal transcribed spacer region of the rrn operon and a real-time Taqman PCR assay based on published primers targeting a genomic insertion element were evaluated for detection and identification of Cmi. Detection of Cmi in alfalfa seed was facilitated by incubation of seed samples in a nutrient medium that promoted growth of Cmi followed by extraction of DNA from the bacterial fraction for use as template in PCR reactions. A real-time Taqman BIO-PCR assay and subsequent confirmation of amplicon identity by melting peak analysis made possible by addition of EvaGreen™ to the reaction mix, was deemed most useful for routine analysis in a diagnostic laboratory setting. The potential of confirming the presence of Cmi in PCR-positive samples by bioassay on alfalfa seedlings was also explored and involved verification of Cmi infections in root-inoculated seedlings by the conventional and real-time PCR assays. Key words: lucerne, Medicago sativa, seed testing, PCR, Taqman assay, melting point analysis. Le flétrissement bactérien de la luzerne (Medicago sativa), causé par Clavibacter michiganenis ssp. insidiosus (Cmi), est une maladie grave qui se répand dans les nouvelles superficies en production par l’intermédiaire de semences infectées. Par conséquent, la détection de Cmi dans les lots de semences est une mesure d’atténuation importante de la maladie. Afin de détecter et d’identifier l’agent pathogène, une PCR traditionnelle, visant la région de l’espaceur intergénique de l’opéron rrn, et une autre de type Taqman en temps réel, basée sur des amorces publiées et visant un élément d’insertion génomique, ont été évaluées. La détection de Cmi dans les semences de luzerne a été facilitée par l’incubation d’échantillons de graines dans un milieu nutritif favorisant la croissance de Cmi, suivie de l’extraction de l’ADN de la fraction bactérienne afin de l’utiliser comme matrice pour les réactions de la PCR. Une épreuve biologique de type Taqman en temps réel, ainsi que la confirmation subséquente de l’identité de l’amplicon par l’analyse des points de dissociation rendue possible par l’ajout d’EvaGreen au mélange, s’est avérée des plus utiles lors d’analyses de routine effectuées au laboratoire de diagnostic. La possibilité de confirmer la présence de Cmi dans les échantillons positifs à la PCR lors d’épreuves biologiques sur des plantules de luzerne a également été explorée et a nécessité la vérification, à l’aide des PCR traditionnelle et en temps réel, de la présence d’infection par Cmi chez les plantules dont les racines avaient été inoculées. Mots-clés : luzerne, Medicago sativa, évaluation des semences, PCR, épreuve Taqman, analyse des points de dissociation.