Factors determining the specificity of the tRNA aminoacylation reaction: Non-absolute specificity of tRNA-aminoacyl-tRNA synthetase recognition and particular importance of the maximal velocity

Abstract

It is generally believed that the specificity of tRNA aminoacylation results solely from a specific recognition between the aminoacyl-tRNA synthetase and the cognate tRNA. In fact, this specificity is not absolute: this is supported by the following observations (1) the existence of tRNA mischarging in homologous systems under usual aminoacylation conditions, (2) the existence of inhibitions produced by « non-cognatetRNA species in correct aminoacylation reactions, (3) the lack of specificity of AMP- and PPi- independent aminoacyl-tRNA synthetase catalysed deacylation of aminoacyl-tRNA species, (4) the isolation of complexes between aminoacyl-tRNA synthetases and non-cognate tRNA species. The affinities between aminoacyl-tRNA synthetases and non-cognate tRNA species, estimated by the Km measurements in mischarging reactions, have been found only diminished by 1 or 2 orders of magnitude as compared to the values found in specific systems, whereas the Vmax values for mischarging have been found diminished by 3 or 4 orders of magnitude. This suggests that tRNA aminoacylation depends more upon the maximal velocity of the reaction than upon the recognition between aminoacyl-tRNA synthetase and tRNA. Furthermore, we found that the recognition of a tRNA by an aminoacyl-tRNA synthetase does not seem to require the 3′ terminal part of the amino acid acceptor stem. As the importance of this part of the tRNA molecule during the aminoacylation process has been well established, it is possible that it is involved in determining the Vmax of the aminoacylation reaction, probably by positioning the 3′ terminal adenosine in the catalytic site of the enzyme. In conclusion, it appears that the specificity of the tRNA aminoacylation reaction proceeds through two discrimination mechanisms: the first one, measured by the Km, acts at the recognition level; the second one, which is more effective, is measured by the Vmax values. Competition phenomena have been observed between cognate and non-cognate tRNA species. They enhance the specificity of the tRNA aminoacylation, but their contribution to the specificity is low compared to that brought by Km and Vmax. Finally we found that a more rapid enzymatic deacylation of mischarged tRNA species (as compared to correctly charged ones) cannot be considered as a general mechanism for correction of misaminoacylation. Il est généralement admis que la spécificité de l'aminoacylation des tRNA résulte seulement de la reconnaissance entre l'aminoacyl-tRNA synthétase et le tRNA correspondant. En fait, les observations suivantes montrent que cette reconnaissance n'est pas absolue: (1) l'existence de charges incorrectes dans des systèmes homologues et dans les conditions habituelles d'aminoacylation, (2) la mise en évidence d'inhibitions produites par des tRNA non spécifiques dans des réactions d'aminoacylation correcte, (3) le manque de spécificité de la désacylation d'aminoacyl-tRNA catalysée par une aminoacyl-tRNA synthétase, en absence d'AMP et de PP1, (4) l'isolement de complexes entre une aminoacyl-tRNA synthétase et des tRNA non spécifiques. Pour un enzyme donné, l'affinité d'un tRNA non spécifique, mesurée par le Km de la réaction d'aminoacylation, diminue de 1 à 2 ordres de grandeur par rapport à l'affinité du tRNA spécifique, alors que la vitesse maximum d'une aminoacylation incorrecte est de 3 à 4 ordres de grandeur inférieure à celle de la réaction correcte. De plus, nous avons trouvé que la reconnaissance d'un tRNA par une aminoacyl-tRNA synthétase ne semble pas requérir la partie 3′ terminale du bras accepteur. Comme l'importance dans l'aminoacylation de cette région du tRNA a été bien établie, il est vraisemblable qu'elle détermine pour une grande part la Vmax de la réaction d'aminoacylation, sans doute par l'intermédiaire du positionnement de l'adénosine 3′ terminale dans le site catalytique de l'enzyme. En conclusion, il apparaît que la spécificité de l'aminoacylation procède de deux mécanismes de discrimination: le premier, mesuré par le Km, intervient au niveau de la reconnaissance, le second, plus efficace. au niveau de la vitesse de la réaction d'aminoacylation. Des phénomènes de compétition dans la réaction d'aminoacylation ont été observés entre des tRNA spécifiques et des tRNA non spécifiques. Ils augmentent la spécificité de l'aminoacylation, mais leur contribution est faible comparée à celle apportée par la Vmax et le Km. Enfin, nous avons constaté que la désacylation enzymatique plus rapide des faux aminoacyl-tRNA par rapport aux tRNA correctement chargés ne peut être considérée comme un mécanisme général de correction des fausses aminoacylations.