山羊地方性鼻内肿瘤病毒（ENTV-2）SYBR-Green I 实时荧光定量PCR检测方法的建立与应用

Abstract

目的 建立一种快速、敏感的ENTV-2检测方法，用于ENT的早期诊断与流行病学调查。 方法 通过生物信息学的方法将ENTV-2与ENTV-1、ERVs、JSRV进行比对，寻找ENTV-2的保守序列并设计1对特异性引物，建立SYBR-Green Ⅰ 实时荧光定量PCR检测方法，对所建立的PCR反应条件进行优化，将PCR扩增产物连接T载体构建的阳性质粒作为标准品，对SYBR-Green Ⅰ 实时荧光定量PCR检测方法的特异性、敏感性和重复性进行验证。 结果 建立的检测ENTV-2 qPCR 方法标准曲线呈现良好的线性关系（R2 ＝0.992）；该方法的特异性良好，对ENTV-2可以产生特异性扩增曲线，与ENTV-2高度同源的ERVs没有交叉反应，也无法扩增羊口疮病毒（ORFV）、绵羊肺炎支原体（Mo）、丝状支原体山羊亚种（Mmc）等常见病原；敏感性良好，最低检测限度为7.5×102 copies·μL−1，敏感性可达常规PCR检测方法的100倍；批内、批间的变异系数CV＜1%，重复性良好；对81份临床样品的阳性检出率为17.3%。 结论 建立的SYBR-Green Ⅰ 实时荧光定量PCR方法特异性良好，敏感性较高，重复性良好，为山羊地方性鼻内肿瘤的早期、快速检测提供了技术支持。