Development of a nylon membrane chip for rapid detecting the diabetes-associated 45 mutant loci in mitochondrial DNA

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目的 构建一种快速、系统检测与糖尿病相关的45个mtDNA位点的膜芯片.方法 针对mtDNA的45个突变位点,采用Primer Premier 5.0和NCBI BLAST软件设计野生型和突变型探针;将带有8T长臂的90条探针,通过紫外交联固定于经5×SSC Buffer处理的尼龙膜;不对称PCR方法制备单链靶序列,纯化后经Biotin标记,AP-avidin作用于NBT/BCIP显色,目视化观察结果.采用该膜芯片检测24份已知mtDNA序列的糖尿病标本,每份标本平行检测3次,评价检测结果.结果 9对引物可在同一条件下特异性扩增45个基因位点的目的片段;野生型和突变型探针的退火温度分别为(59.01±1.42)℃、(59.34±1.29)℃,能够在相同的温度下完成杂交反应;膜芯片样点清晰、规整度好,分布均匀,无漏点和连点,阳性对照和阴性对照结果理想,阴性对照的信号强度与背景持同;除16189位点外,检测结果与DNA测序方法有很好的一致性(x2=113.132,Kappa值=0.888,P=0.000).结论 成功构建可一次性检测目前国内外报道与糖尿病相关的44个mtDNA突变位点的膜芯片,适用于糖尿病患者和高危人群的检测。