Detaillierte Analyse der Bindepräferenz von Roquin an RNA‐Stammschleifen

Abstract

AbstractDie Konzentration von mRNAs in der Zelle wird posttranskriptionell durch cis‐regulierende Elemente in der 3’‐untranslatierten Region gesteuert. Diese linearen oder strukturierten Elemente werden von RNA‐bindenden Proteinen (RBPs) erkannt, um die mRNA‐Stabilität zu kontrollieren. Die Proteine Roquin‐1 und −2 erkennen spezifisch RNA‐Stammschleifenmotive. Mit ihrer einzigartigen ROQ‐Domäne erkennen sie Trinukleotid‐Schleifen enthaltende konstitutive Degradationselemente (engl. constitutive decay elements, CDEs) und Hexanukleotid‐Schleifen enthaltende alternative Degradationselemente (engl. alternative decay elements, ADEs), um den mRNA‐Abbau zu initiieren. Die RNA‐Bindekapazität von Roquin gegenüber verschiedenen Klassen von Stammschleifen ist bis jetzt nicht genau charakterisiert, so dass die genauen Bindepräferenzen unklar sind. Hier katalogisieren wir die RNA‐Bindepräferenz der ROQ‐Domäne auf Nukleotidebene mit sRBNS (engl. structured RNA Bind‐n‐Seq), einem neuartigen und angepassten RBNS Protokoll mit strukturierten RNA‐Bibliotheken. Dadurch konnte eine klare Präferenz von Roquin für bestimmte Schleifengrößen festgestellt werden und die bekannten Konsensusmotive für CDEs und ADEs erweitert werden. Die neu identifizierten Motive werden mit nanomolarer Affinität über die bekannte RNA‐ROQ‐Bindung erkannt. Unter Verwendung dieser neuen Stammschleifenvarianten als Blaupausen haben wir neue Ziel‐mRNAs von Roquin vorhergesagt und den erweiterten Targetraum in Zellen verifiziert. Diese Studie demonstriert die Leistungsfähigkeit von Hochdurchsatzverfahren mit RNA‐Strukturen für die systematische Untersuchung von (strukturellen) RNA‐Bindepräferenzen zur detaillierten Identifizierung von mRNA‐Targets und zur Aufklärung der biologischen Funktion von RBPs.