Desenvolvimento de iniciadores para detecção e identificação de Diaporthe phaseolorum var. meridionalis em sementes de soja

Abstract

Considerando a grande variabilidade apresentada pelo complexo Diaporthe/Phomopsis, os métodos rotineiros de sanidade de sementes, empregados na detecção do gênero Diaporthe, não são confiáveis visto que, para sua identificação são utilizadas as características morfológicas das colônias que se desenvolvem sobre as sementes. Diante disso, este trabalho teve como objetivo desenvolver iniciadores específicos, bem como um método confiável para detecção e identificação de Diaporthe phaseolorum var. meridionalis (Dphm), em sementes de soja. Amostra de sementes da cultivar IAS5, analisada previamente para sanidade, não portadoras de Diaporthe (SS) foram inoculadas com Dphm (SI), obtendo-se amostras com as seguintes proporções de SI:SS: 1:10, 1:50, 1:100, 1:200 e 1:400. Para a extração de DNA do micélio do patógeno das sementes foi necessário primeiro incubar as sementes por 7 dias, utilizando-se o método do papel de filtro modificado com 2,4 D e, em seguida submetê-las à lavagem em tampão de extração (1% de SDS, 10 mM de TRIS/HCL e 25 mM de EDTA) por 20 min, sob agitação a 100 rpm. Em seguida, alíquotas de 350 miL do sobrenadante foram transferidas para novos microtubos contendo 350 miL de resina de sílica gel da Wizard/Promega permanecendo em contacto com a mesma por 1 minuto. Os DNAs extraídos foram utilizados como molde na reação de PCR com os iniciadores: DphLe (TCG GCC TTG GAA GTA GAA AG) e DphRi (ACT GAA TGC GTT GCG ATT CT) Utilizando-se estes iniciadores, foi possível detectar a presença de D. phaseolorum var meridionalis em sementes de soja, na proporção de uma semente infectada com o patógeno em amostras de 400 sementes (0,25% de incidência), utilizando-se o método do papel de filtro modificado com 2,4 D associado à técnica de PCR.