以 Real-Time PCR 建立紫色不含硫光合作用細菌之最佳定量方法

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紫色不含硫光合作用細菌已經被成功地應用於高濃度有機廢水處理上，亦曾被利用於處理廢水或土壤中難分解之苯環物質；除了應用在污染物去除之外，紫色不含硫菌因具有產生氫氣的能力，近年來被許多學者將其應用於生物產氫之研究上；本實驗室於生物產氫的研究中，意外發現紫色不含硫菌具有在體內累積聚磷酸鹽的能力，其體內所累積之聚磷酸鹽濃度可達一般除磷菌的2 – 3倍以上。由上述內容可知，紫色不含硫菌於環工上具有相當多元之應用價值，因此至今仍為諸多環工學者進行研究之熱門對象，也將是本研究所針對的研究目標。 環境微生物學中，除了菌相之鑑定與生理特性研究外，菌種於環境中所佔有之數量也是相當重要之研究課題。早期以傳統方法進行菌量計算往往會發生低估的可能，即時定量聚合酶鏈鎖反應(Real-Time PCR)是分子生物技術應用於細胞定量上之一大突破，許多研究皆證實Real-Time PCR具有更高的靈敏度與準確性，近來已陸續應用於環境微生物的定量上，然而國內環工界仍鮮少看到相關之應用。因此，本研究之目的便以Real-Time PCR作為紫色不含硫光合作用細菌的定量工具，同時搭配不同的傳統定量方法進行比較，希望能強調出Real-Time PCR之定量優勢，建立出一套屬於紫色不含硫光合作用細菌的最佳定量方法。 研究中，首先以cloning的方式將已知濃度之研究目標序列(pufM gene)嵌入質體中，進行系列稀釋作為定量所需的標準品，由Real-Time PCR之螢光偵測，先建立出Real-Time PCR定量紫色不含硫菌之標準曲線。而樣本之準備上，許多學者曾提及，樣本DNA之萃取效率將影響到樣本以Real-Time PCR進行定量的準確性，為了決定DNA的最佳萃取方式，本實驗共挑選了六種不同之商業套組(編號：A – F)進行DNA萃取，以核酸偵測(A260 /A280)結果作為判斷依據，結果顯示A套組於相同菌液中萃取出之DNA濃度與純度皆最高，表示以此套組所萃取的DNA最能代表來自所有菌體，因此最適於用在樣本DNA之準備上。樣本DNA順利萃取後，便可直接以Real-Time PCR進行螢光偵測並換算出相對菌量，完成所有之定量程序。 本研究後續利用所建立之Real-Time PCR定量方法搭配其它定量方式，比較純種培養與環境樣本中紫色不含硫光合作用細菌的菌量。在純菌的定量上，實驗結果顯示平板計數法、DAPI染色與Real-Time PCR的定量結果相差不大，其中Real-Time PCR方法數值略高一些，判斷在純種培養的單純條件下，三種方法皆適於應用在菌株定量上，而Real-Time PCR則能克服平板計數法與DAPI染色於抹碟及濾膜轉貼時所造成部分菌體流失的缺點，使得定量結果更趨近實際菌量；此外，本研究針對多種環境水體與活性污泥進行定量比較，實驗結果顯示，Real-Time PCR的定量結果比平板計數高出101 – 104倍，本實驗證實傳統培養存在外來菌種競爭的問題，且以醋酸納為電子供給者之條件下，環境中部分紫色不含硫菌種亦可能無法利用其生長，因此平板計數法確實會造成嚴重低估的現象，而Real-Time PCR的結果可能與實際菌量較為接近。 除了準確性較高之外，以往傳統培養定量紫色不含硫菌的時間需求至少為5 – 7天，如今以Real-Time PCR操作則不需1小時，如此省時又準確之優勢條件，Real-Time PCR確實為紫色不含硫光合作用細菌之最佳定量方法。