Abstract
Aim. In this study we aimed to develop the methodology to change the antigen specificity of chimeric antibodies by replacing the variable region genes in the previously designed universal plasmid constructions pLK DT-17 and pHG DT-17 encoding the DT-17 antibody against the diphtheria toxin (DT) to the genes of antibody binding to another DT epitope — DT-22. Materials and methods. The genes of the light and heavy chain variable regions of mouse anti-DT antibodies — DT-22 were amplified from the hybridoma producing monoclonal antibodies to DT by reverse transcription and PCR methods. Genetic engineering methods were used to replace the variable regions of DT-17 antibody in the recombinant plasmids pLK DT-17 and pHG DT-17 encoding the light and heavy chains of DT-17 antibody, respectively to the relevant genes of DT-22. Subsequently, a «supervector» pSV DT-22, containing the genes of both chains of the chimeric antibody, was designed. CHO cells were transfected with a «supervector» and a highly productive clone, secreting chimeric antibodies to DT was obtained. Immunochemical and cultural methods were used to evaluate antibody activity. The affinity chromatography was used to purified preparative amounts of antibodies. Results. The yield of purified secreted chimeric DT-22 antibodies was 4 mg from per liter of culture medium. The minimum concentration of chimeric antibodies at which DT was neutralized in the CHO cells was 22 μg/mL of medium. Conclusion. Thus it has been shown how to generate new vector coding synthesis of light and heavy chains of a chimeric DT-22 antibody specific to another DT epitope using previously constructed universal recombinant plasmids pLK DT-17 and pHG DT-17 encoding, light and heavy chains of antibodies against DT DT-17, respectively.
Highlights
Ключевые слова: иммуноглобулиновые гены, «супервектор», рекомбинантные антитела, дифтерийный токсин, токсиннейтрализующая активность, клонирование, трансфекция, культура клеток СНО
In this study we aimed to develop the methodology to change the antigen specificity of chimeric antibodies by replacing the variable region genes in the previously designed universal plasmid constructions pLK DT-17 and pHG DT-17 encoding the DT-17 antibody against the diphtheria toxin (DT) to the genes of antibody binding to another DT epitope — DT-22
Контактная информация: Самарцева Т.Г., 105064, Москва, М.Казенный пер., 5а, р.т. (495)91700
Summary
В исследовании использовалась гибридома DT-22, продуцирующая моноклональные антитела, которые обладают нейтрализующей активностью в отношении дифтерийного токсина. Гибридомы-продуценты антител к дифтерийному токсину культивировали на среде RPMI 1640 с добавлением 10% сыворотки плода коровы и глутамина. При сохранности специфичных для каждого клона характеристик, клетки, взятые на стадии экспоненциального роста, осаждали центрифугированием; осадок клеток использовали для выделения суммарной РНК с использованием набора реагентов RNeasy Mini Kit («Qiagen», Германия). Получение кДНК в реакции обратной транскрипции (ОТ), амплификацию доменов вариабельных участков иммуноглобулинов мыши, а также встраивание их в плазмиду, секвенирование ампликонов и плазмиды для контроля правильности полученной конструкции проводили в соответствии со стандартными методами генной инженерии. Культуру клеток СНО культивировали на питательных средах RPMI («Панэко», Россия) или Opti-MEM («Invitrogen», США) с добавлением и без добавления фетальной бычьей сыворотки («Gibco», США) в количестве 2,55%. Для трансфекции клеток использовали реактив Lipofectamine 2000 («Invitrogen», США) согласно рекомендациям производителя, а для аффинной очистки иммуноглобулинов — протеин-G сефарозу («Биалекса», Россия)
Talk to us
Join us for a 30 min session where you can share your feedback and ask us any queries you have
More From: Journal of microbiology, epidemiology and immunobiology
Disclaimer: All third-party content on this website/platform is and will remain the property of their respective owners and is provided on "as is" basis without any warranties, express or implied. Use of third-party content does not indicate any affiliation, sponsorship with or endorsement by them. Any references to third-party content is to identify the corresponding services and shall be considered fair use under The CopyrightLaw.