The Partial Purification and Characterization of Polyphenol Oxidase in Native Grape Kirmizi Kismisi Cultivar (Vitis vinifera L.) Grown in Iğdır Province

Abstract

Yerel üzüm çeşidi Kırmızı Kişmişi, Türkiye’nin Iğdır ilinin Necefali köyünden toplandı ve daha sonralaboratuvara taşındı ve -20 °C’de dondurularak saklandı. Kırmızı Kişmişi’den polifenol oksidaz aseton çöktürmesiyöntemi kullanılarak 5.45 kat kısmi olarak saflaştırıldı ve karakterize edildi. 50 gr Kırmızı kişmiş üzümü hücrezarlarını parçalamak için porselen havanda dövüldü. Dondurulmuş Kırmızı kişmişi üzümü %1 polietilen glikol(PEG) içeren 100 mL 50 mM sodyum asetat tamponuyla (pH 5.0) homojenize edildi. Daha sonra homojenat, 4katlı tulbentten süzüldü ve elde edilen süzüntü 4°C’de 30 dakika 10 000 rpm’de santrifüjelendi. Santrifüjden sonraelde edilen süpernatant, buz banyosunda süpernatanın hacmine kadar soğuk aseton eklendi ve karışım proteinlerinçökeltilmesi için gece boyunca 4°C’de inkübe edildi. 4°C’de 30 dakika 10 000 rpm’de santrifüj edildikten sonra,çökelti 20 mL 50 mM sodyum asetat tamponu (pH 5.0) içinde yeniden çözündürüldü. Protein konsantrasyonuLowry yöntemine göre belirlendi. Ham enzim özütü ve aseton çöktürmesi sonrası protein konsantrasyonlarısırasıyla 7.04 ve 3.83 mg/mL olarak belirlendi. Katekol substratı kullanılarak, optimum pH ve sıcaklık değerlerisırasıyla 6.0 ve 20°C bulundu. Buna ek olarak, Km ve Vmaks değerleri gibi bazı biyokimyasal özellikler araştırıldı.PFO enzimi için askorbik asit, sitrik asit, sodyum metabisülfit ve benzoik asit ile inhibisyon çalışmaları yapılmış,herbir inhibitör için IC50 hesaplanmıştır. Bu çalışmadan elde edilen veriler, bu enzimin gıda endüstrisi için yararlıolabileceğini gösterdi.