The efficacy of CRISPR-Cas9-mediated induction of the CCR5delta32 mutation in the human embryo

Abstract

Изменение гена CCR5 путем редактирования генома CD4+-T-клеток является одним из способов предотвращения распространения ВИЧ-1-инфекции. Однако похожая стратегия защиты от ВИЧ может быть использована и для защиты плода ВИЧ-инфицированных женщин со слабым ответом на антиретровирусную терапию. Создание «естественного» аллеля CCR5delta32 на стадии зиготы может защитить плод от ВИЧ-инфекции во время внутриутробного развития и родов. Целью данного исследования была оптимизация системы CRISPR-Cas9 под создание гомозиготной 32-нуклеотидной делеции (аналогичной природному варианту CCR5delta32) в S-фазе зиготы человека. Для редактирования генома были использованы зиготы с аномальным числом пронуклеусов (более двух), непригодные для ЭКО. 16 аномальных зигот от доноров с WT CCR5 были инъецированы разработанной системой CRISPR-Cas9 в S-фазе. После инъекции зиготы помещали в культуральную среду Blastocyst (COOK) и культивировали в течение 5 дней в CO2-инкубаторе до стадии бластоцисты (приблизительно 250 клеток). Для анализа эффективности редактирования генома 8 успешно развивавшихся эмбрионов были генотипированы методом полимеразной цепной реакции (ПЦР). Из 16 зигот, инъецированных системой CRISPR-Cas9, лишь 8 достигли стадии бластоцисты. ПЦР-генотипирование показало отсутствие исходного варианта WT CCR5 в 5 из 8 бластоцист (100% гомозиготы по CCR5delta32). Два эмбриона продемонстрировали около 3% и один — около 20% мозаицизма по WT CCR5. Таким образом, эффективность разработанной CRISPR-Cas9 системы для создания аллеля CCR5delta32 в эмбрионах человека довольно высока: более половины эмбрионов оказываются полностью модифицированными.