Sur la morphologie des trypsines de porc et de bœuf étude des dénaturations reversibles

Abstract

The morphology of porcine and bovine trypsins (EC 3.4.4.4) has been investigated using kinetic, spectropolarimetric and spectrophotometric techniques to study the reversible denaturations induced by pH and temperature changes. Porcine trypsin is more stable than bovine trypsin to the different types of denaturation (alkaline, acidic and thermal). The conformation of both trypsins is well ordered between pH 7 and 8 but is considerably less ordered at pH values more acidic or alkaline. The α-helix content of both proteins is very low and is nearly identical. The helix content changes with pH, reaching a maximum value between pH 7 and 8. This periodic structure may be of importance in maintaining the morphology of the active center. The binding of Ca2+, which decreases the rate of autolysis, induces a conformational change in the trypsin molecule resulting in a more compact structure. This investigation has given evidence for different molecular species of trypsin (1) Ta, the only species with enzymic activity, is predominant at pH 7 to 8; (2) Tial results from the alkaline denaturation of Ta at 30° or 35°; (3) Tiac results from the acidic denaturation of Ta at the same temperatures; (4) Dac results from the thermal denaturation of Ta and Tiac. The thermodynamic parameters of the different conformational conversions have been examined. A number of masked residues are found in the Ta species of both bovine and porcine trypsins: (1) tryptophan; (2) aspartic or glutamic carboxylate groups; (3) tyrosine: 4 residues in porcine trypsin and 5 in bovine trypsin, the phenolic groups being masked in the acidic form. The unmasking of the abnormal ionisable functions of Ta during denaturation determines the influence of pH on trypsin morphology. The stabilization of Ta is essentially a result of hydrophobic interactions. L’étude morphologique des trypsines de bœuf et de porc a été abordée par l’analyse cinétique, spectropolarimétrique et spectrophotométrique des dénaturations réversibles induites par les changements de pH ou de température. La trypsine de porc est plus stable que la trypsine de bœuf vis à vis des différents types de dénaturation (alcaline, acide et thermique). La structure spatiale des deux trypsines est particulièrement bien ordonnée entre pH 7 et 8; elle l’est beaucoup moins en milieu plus acide ou plus alcalin. Les deux protéines ont un pourcentage d’α-hélice identique, et très faible, qui dépend du pH et atteint un maximum entre pH 7 et 8. Cette structure périodique semble jouer un rôle dans le maintien de la conformation du centre actif. Ca2+, qui diminue la vitesse d’autolyse des trypsines, modifie leur structure spatiale pour la rendre plus compacte. Les études réalisées permettent de mettre en évidence plusieurs espèces moléculaires de trypsine. (1) La forme Ta active est prédominante à pH 8 (2) la forme Tial inactive provenant de la dénaturation alcaline de Ta aux mêmes températures (4) la forme Dac inactive provenant de la dénaturation thermique de Ta et Tiac. Nous donnons une interprétation thermodynamique de ces modifications de conformation. La forme Ta des trypsines de porc et de bœuf possède un certain nombre de résidus masqués: des résidus de tryptophane; des résidus aspartate ou glutamate, enfin 4 (trypsine de proc) ou 5 (trypsine de bœuf) résidus de tyrosine. Les fonctions phénol sont masquées sous leur forme acide. Le caractère ionisable de certaines des fonctions démasquées durant la dénaturation explique pourquoi la conformation des trypsines dépend du pH. Néanmoins, la stabilisation de l’espèce Ta sous sa forme globulaire est essentiellement due à des interactions hydrophobes.