Rapid DNA extraction and PCR validation for direct detection of Listeria monocytogenes in raw milk

Abstract

Objetivo. Validar un método para la detección directa de L. monocytogenes en leche cruda. Materiales y métodos. Se utilizó un procedimiento de extracción con el agente caotropico NaI, para reducir la grasa en la muestra a un 0.2% p/v, el cual es mas bajo limite de detección con el método de Gerber para evitar la polimerización. Las muestras de leche cruda fueron analizadas por el método estandar de oro para la detección de L. monocytogenes. La detección por PCR fue realizada amplificando el segmento específico de 938bp de 16S ADNr. Los siguientes cebadores fueron utilizados L1 (CTCCATAAAGGTGACCCT), U1 (CAGCMGCCGCGGTAATWC), LF (CAAACGTTAACAACGCAGTA) and LR (TCCAGAGTGATCGATGTTAA) que reconoce el gen hlyA de L. monocytogenes y que amplifica un fragmento de 750bp.Resultados. El ADN de 39 cepas evidenció una alta especificidad de la técnica ya que todas las 39 L. monocytogenes amplificaron los fragmentos de 938bp y 750bp especie especifica. El límite de detección de la PCR fue de 101 CFU/ml. La reproducibilidad de la PCR mostró un Kappa de 0.85, la especificidad y sensibilidad fueron del 100%. El valor predictivo positivo y negativo fue del 100%. Conclusiones. Los resultados demostraron que es posible detectar Listeria spp usando cualquiera de los tres métodos ya que poseen la misma sensibilidad y especificidad. El 100% del valor predictivo positivo provee una alta posibilidad de detección en muestras positivas con listeria. EL método de extracción y la PCR estandarizada permiten en 15 días detectar L. monocytogenes en leches crudas. La técnica de PCR puede ser adaptada y validada otros tipos de alimentos como pollos, carnes y quesos.