Purification of RNA Polymerase Elongation Complexes for Cryoelectron Microscopy Investigation

O V Chertkov,M G Karlova,N S Gerasimova,O S Sokolova

doi:10.3103/s0096392518030045

Abstract

A procedure was developed for the preparation of a stalled elongation complex of Escherichia coli RNA polymerase with the nucleosome for investigation by cryo-electron microscopy. We purified the complex from the excess of free RNA polymerase and unproductive complexes on heparin resin and concentrated it on an affine monolayer formed by lipids bound to Ni ions. The use of affinity grids with an immobilized lipid monolayer helps to prevent aggregation of the particles on the grid surface. This technique can be used in the future to obtain a three-dimensional reconstruction of the EC+39 elongation complex.

Highlights

Прохождение РНК-полимеразы через хроматин характеризуется высоким нуклеосомным барьером транскрипции
Последовательность нуклеотидов ДНК была модифицирована таким образом, чтобы образовался участок, не содержащий основания T от старта транскрипции до положения +39
This technique can be used in the future to obtain a three-dimensional reconstruction of the EC+39 elongation complex

Summary

Материалы и методы

Фрагменты ДНК для работы получали методом ПЦР с использованием описанной плазмиды в качестве матрицы и олигонуклеотидов 282Forwhst и 282Revwhst. Для получения элонгационного комплекса в положении +39 от начала нуклеосомы использовали РНКполимеразу E. coli, экспрессированную и очищенную, как было описано нами ранее [9]. Для получения открытого комплекса брали 100 нг ДНК матрицы, ассоциированной с нуклеосомой, и добавляли холофермент РНК-полимеразу E. coli в пятикратном молярном избытке, затем инкубировали полученную смесь при 37°C в течении 10 мин. Для получения комплекса ЕС+39 к раствору, содержащему ЕС–39, добавляли KCl до концентрации 150 мМ и ЦТФ (5 мМ), а затем инкубировали полученную смесь 10 мин при комнатной температуре. Приготовленные, как указано выше, снимали с капли раствора, помещали в прибор для замораживания образцов Vitrobot MarkIII (FEI, США) и замораживали в жидком этане при следующих параметрах: время промокания 4 с, температура климатической камеры +12°C, влажность 95%.

Результаты и обсуждение

СПИСОК ЛИТЕРАТУРЫ

METHODS