Purification and characterisation of an intracellular aminopeptidase from Brevibacterium linens ATCC 9174

Abstract

Une aminopeptidase intracellulaire de Brevibacterium linens ATCC 9174 a ete purifiee 4300 fois par homogeneisation et fractionnement au sulphate d'ammonium, chromatographie d'echange d'anions, chromatographie par interactions hydrophobes et chromatographie d'echange d'anions. Le pH et la temperature optimale etaient respectivement de 8,5 et 35 °C. L'aminopeptidase etait stable, de pH 8 a 10. De plus, elle etait stable thermiquement a 20 °C a pH 8,5. La masse moleculaire de l'enzyme, determinee par SDS-PAGE et filtration sur gel etait respectivement de 59 kDa et 69 kDa, ce qui indique que l'enzyme native existe sous forme de monomere. L'activite enzymatique est fortement inhibee par l'agent bloquant les groupements thiols, le p-hydroxymercuribenzoate, et par les ions Co 2+ et Zn 2+ ; l'activite enzymatique n'est pas inhibee par les chelateurs de metal, les agents reducteurs ou le fluorure de phenylmethylsulphonyle. Les valeurs K m et k cat pour le L-Ala-p-NA etaient respectivement de 3,3 mmol/L et 4,3 s -1 , tandis que les valeurs correspondantes pour L-Gly-p-NA etaient respectivement 0,2 mmol/l et 7,6 s -1 . L'aminopeptidase hydrolysait les dipeptides possedant un residu alanine en N-terminal mais les tripeptides n'etaient pas hydrolyses. L'ordre des 19 premiers acides amines N-terminaux etait NH 2 -Pro-Phe-Asp-Gly-Pro-Asp-Thr-Ala-Ala-Ile-Ile-Asp-Arg-Leu-?-Asn-Ala-?-Thr.