Prokaryotic expression of human cTnI and preparation of anti-cTnI monoclonal antibody

Abstract

目的 构建人心肌肌钙蛋白I(cTnI)的表达载体,表达cTnI重组蛋白,并制备其单克隆抗体(mAb).方法以化学方法合成cTnI基因并插入融合表达载体pBV220的多克隆位点,构建重组表达质粒pBV220/ cTnI.以重组质粒转化大肠杆菌DH5α,筛选阳性重组子,经热激诱导目的蛋白的表达,表达产物的免疫学活性用Western blot进行鉴定.以基因重组的cTnI蛋白为抗原,常规方法免疫BALB/ c 小鼠,取其脾细胞与NS-1细胞融合,获得稳定分泌cTnI mAb的杂交瘤细胞株,ELISA 检测mAb的相对亲和力;Western blot检测mAb的特异性.结果酶切鉴定和DNA 测序显示cTnI重组表达载体中含有人cTnI全长编码序列.将该重组载体转化入大肠杆菌DH5α中表达所得蛋白经Western Blot验证为目的蛋白.筛选出2 株能稳定分泌特异性抗cTnI的mAb 杂交瘤细胞株,免疫球蛋白亚类均为IgG类;Western blot结果显示,两株单抗识别相对分子量为24 000的cTnI单一条带;中和抑制试验表明培养上清中的抗体能明显被cTnI中和;cTnI单克隆抗体的亲和常数为Kaff = 1.62 ×109 (mol/ L)-1.结论成功地构建了cTnI表达载体、表达出cTnI重组蛋白,制备出抗cTnI mAb,为进一步用于cTnI的体外免疫学检测奠定了基础。