百合Plantago asiatica mosaic virus檢測試劑製備與提升病毒檢出率之血清檢定法研發

Abstract

2011年初於國外進口之百合種球首次以核酸檢測法檢出一種屬於Potexvirus之病毒核酸片段，由核酸序列鑑定確認其為國外已報告之車前草嵌紋病毒（Plantago asiatica mosaic virus；PlAMV）。進一步依據GenBank上已登錄之PlAMV核酸序列，設計可增幅全長度鞘蛋白基因序列之引子對PlAMV-cpup（5'-CCGCGGCCGCCACACTACTC）及PlAMV-cpdw（5'-GGCCCACCAGACTTTCACT），針對進口百合種球之罹病組織（代號LV1）之全量核酸進行RT-PCR檢測，可增幅出預估933bp之核酸片段產物，此核酸片段進一步選殖與定序結果，證實其帶有PlAMV之全長度鞘蛋白基因，且與GenBank上已登錄之PlAMV病毒（accession no. AB360794.1）之鞘蛋白胺基酸序列相同度高達93%以上。利用細菌表現蛋白系統所生成之PlAMV-LV1鞘蛋白作為抗原進行抗血清製備，所製備出之PlAMV-LV1多元抗體可成功應用於Indirect ELISA（Indirect enzyme-linked immunosorbent assay）及西方轉漬法（western blotting）等血清檢定法而專一性地檢出此病毒，並發現以直接組織轉漬法（direct tissue blotting；DTB）於植株不同部位組織上對此百合病毒的檢出率均顯著高於用ELISA檢測的結果；植株地下部之病毒檢出率，由根系檢出者顯著地高於由種球鱗片檢出者。運用PlAMV-cpup／PlAMV-cpdw引子對，可應用於不同品系百合的PlAMV CP之RT-PCR檢測。由上述結果顯示，本研究所開發之PlAMV血清與核酸檢測試劑，可應用於百合之PlAMV檢定，尤其DTB法為一種可有效地提升百合檢出PlAMV的血清檢定方式。