研究PERP (p53 apoptosis effect related to PMP-22) 基因對人類肺癌細胞株生長的影響

Abstract

PERP(p53 apoptosis effect related to PMP-22)蛋白是在細胞膜上穿膜四次的膜蛋白，基因位置在染色體6p24，此區域是黑色素瘤、子宮頸癌、卵巢癌、乳癌常發生loss of heterozygosity (LOH) 的位置。因與PMP-22蛋白家族同源性高，故歸類為PMP-22家族的一員。過去報導指出，PERP在不同的細胞內，會受到p53或p63的調控，而扮演著不同的腳色。在MEFs細胞內，主要是受到p53調控，引發細胞走向凋亡。而在上皮細胞內，則是受到p63所調控，其功能則是影響上皮細胞的發育及分層。我們利用PERP抗體進行IHC，分析肺癌的tissue array, 發現有83%的肺腺癌及98%的鱗狀上皮癌罹過度表現PERP。在肺癌細胞株中， H1299、H1355、CL1-5及A549 PERP的mRNA表現量高，而CL1-0、H661的PERP mRNA表現量低。我們由A549及H1299細胞中得到十三個PERP cDNA clones，發現大部分的cDNA clones在538的位置上有一個missense突變，而只有一個clone是屬於wild type的序列。因此，我們在CL1-0細胞中過度表現wild type PERP及有538 mutation 的PERP基因，並在A549及CL1-5抑制PERP基因的表現。奇怪的是，我們一直無法利用shRNA由A549及CL1-5細胞中，篩選出具有穩定抑制PERP的細胞株，這情形暗示著PERP是肺癌細胞生存所必需的蛋白。由於有報導指出，高氧處理的細胞會過度表現PERP，這暗示細胞內因高氧產生的ROS可能會促進PERP的表現。而高代謝率的癌細胞也會產生較多的ROS，因此我們懷疑在肺癌細胞裡過度表現的PERP可能與ROS有關。為了探討PERP對肺癌細胞的影響，我們利用會引發細胞產生ROS的gallic acid處理細胞，觀察PERP的表現與細胞抗gallic acid的關係。結果顯示，利用si-RNA將內生性PERP的表現抑制後，A549及CL1-5細胞的侵犯能力被抑制，而細胞生長不受影響。但是，處理gallic acid之後，PREP被siRNA抑制的細胞生長速度較表現PERP的細胞慢。欲確定gallic acid抑制細胞生長與ROS的關係，我們以NAC (N-acetyl Cysteine)與gallic acid同時處理細胞，以降低gallic acid所產生的ROS。結果顯示，NAC可以解除gallic acid對不表現PERP細胞生長抑制的現象。接著，我們利用過度表現PERP的細胞，驗證PERP的表現可以抗gallic acid所產生的ROS。當CL1-0細胞過度表現wild type PERP及具有538 mutation的PERP時，細胞生長的速度與載體控制組相當。但處理gallic acid後，過度表現538 mtutation的PERP的細胞所形成之群落較載體控制組大，而過度表現wild type PERP的細胞，其群落大小則與載體控制組相當。 由本研究，我們推測PERP蛋白在肺癌的細胞過度表現的功能有二；其一是與細胞的侵犯能力有關，其二是保護細胞免於ROS的傷害。因此，若能找出參與PERP保護細胞的機制，則可以發展抑制這個機制的方法，進而應用於治療肺癌上。