Abstract
Padronizou-se uma técnica de reação em cadeia da polimerase múltipla (PCR multiplex) para detecção de Clostridium chauvoei e Clostridium septicum em culturas puras. Foram utilizados pares de iniciadores para segmentos específicos dos genes que codificam a flagelina de C. chauvoei e a toxina alfa de C. septicum. Para avaliaçã o da PCR multiplex, foram testados 16 isolados clínicos de C. chauvoei e 15 isolados de C. septicum provenientes de ruminantes, quatro sementes vacinais de cada um desses agentes. Amostras de referência de ambos os microrganismos foram usadas como controle. Para avaliar a especificidade, DNAs genômicos dos seguintes microrganismos foram usados: C. sordellii, C. novyi tipo A, C. novyi tipo B, C. perfringens tipo A, C. haemolyticum, C. botulinum tipo D, Pseudomonas aeruginosa, Staphylococcus aureus, Enterobacter aerogenes, Escherichia coli e Salmonella typhimurium. Todos os isolados e sementes vacinais de C. chauvoei e C. septicum foram detectados pela técnica. Não foram observadas reações cruzadas com as outras espécies de clostrídios, outras espécies bacterianas ou entre C. Chauvoei e C. septicum. As menores concentrações de DNA de C. chauvoei e C. septicum detectadas foram 45pg/µl e 30pg/µl, respectivamente. A PCR multiplex pode ser utilizada para a identificação específica de C. chauvoei e C. septicum em culturas puras.
Highlights
From C. chauvoei and C. septicum were 45pg/μl and 30pg/μl, respectively
The multiplex PCR was useful for the specific identification of C. chauvoei and C. septicum in pure cultures
Depois de verificado crescimento e pureza pelo Gram, os isolados foram novamente subcultivados em 15ml de caldo cérebrocoração1 e incubadas como descrito acima
Summary
ATCC= American type culture collection; NCTC= National collection of type cultures. Após o término da PCR, os produtos amplificados, separados pela eletroforese foram visualizados em gel de agarose a 1% corado com brometo de etídeo (0,5μg/ml). 1kb Plus DNA Ladder, foi usado como marcador de peso molecular. Após o término da PCR, os produtos amplificados, separados pela eletroforese foram visualizados em gel de agarose a 1% corado com brometo de etídeo (0,5μg/ml). Para certificação da identidade dos produtos amplificados, uma amostra de C. chauvoei usada na produção de vacina e o isolado de C. septicum Itaperuna proveniente do estado do Rio de Janeiro foram novamente amplificados. As bandas correspondentes aos produtos da PCR de C. chauvoei e de C. septicum, foram cortadas do gel com auxílio de um bisturi estéril e purificadas separadamente usando-se o kit Wizard SV Gel e PCR Clean-Up System A92812. Posteriormente os DNAs dessas amostras foram submetidas para seqüenciamento no Bioagro/UFV/Minas Gerais. Para se determinar a menor concentração de DNA detectada pela técnica, foram realizadas diluições decimais (10-1 a 10-6), a partir de concentrações de 450ng/μl e 300ng/μl de DNA genômico das amostras de C. chauvoei - ATCC 10092 e C. septicum - ATCC 12464, respectivamente
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