Abstract
The nucleotide excision repair (NER) is one of the main repair systems present in the cells of living organisms. It is responsible for the removal of a wide range of bulky DNA lesions. We succeeded in developing a method for assessing the efficiency of NER in the cell (ex vivo), which is a method based on the recovery of TagRFP fluorescent protein production through repair of the damage that blocks the expression of the appropriate gene. Our constructed plasmids containing bulky nFlu or nAnt lesions near the tagrfp gene promoter were shown to undergo repair in eukaryotic cells (HEK 293T) and that they can be used to analyze the efficiency of NER ex vivo. A comparative analysis of the time dependence of fluorescent cells accumulation after transfection with nFlu- and nAnt-DNA revealed that there are differences in how efficient their repair by the NER system of HEK 293T cells can be. The method can be used to assess the cell repair status and the repair efficiency of different structural damages.
Highlights
В данной работе приведено описание разработанного нами метода, который позволяет проводить такие оценки с использованием модельных плазмид с объемным повреждением вблизи промоторной области гена, кодирующего флуоресцентный белок TagRFP
Из плазмиды pTagRFP-N с помощью эндонуклеаз рестрикции HindIII и BamHI («СибЭнзим») вырезали участок длиной 38 п.н. (622–660 п.н., MCS) путем инкубации 1 мкг плазмиды с 1 ед
Флуоресценцию регистрировали с использованием системы для длительного прижизненного наблюдения за клетками Cell-IQ MLF (Chip-Man Technologies, Финляндия) в ЦКП клеточных технологий ФИЦ ИЦиГ СО РАН
Summary
Метод оценки эффективности работы системы эксцизионной репарации нуклеотидов ex vivo. РЕФЕРАТ Эксцизионная репарация нуклеотидов (ЭРН) – одна из основных систем репарации, которая отвечает за удаление широкого спектра объемных повреждений ДНК. Разработан метод анализа эффективности ЭРН в клетке (ex vivo), основанный на восстановлении продукции флуоресцентного белка TagRFP в результате репарации повреждений, блокирующих экспрессию соответствующего гена. Что сконструированные плазмиды, содержащие объемные повреждения nFlu или nAnt вблизи промотора гена tagrfp, подвергаются репарации в эукариотических клетках (HEK 293T) и могут быть использованы для анализа эффективности ЭРН ex vivo. ВВЕДЕНИЕ Система эксцизионной репарации нуклеотидов (ЭРН) с высокой эффективностью удаляет из ДНК объемные повреждения, возникающие в результате воздействия различных факторов – химически активных соединений, УФ- и рентгеновского излучения. Общегеномная ЭРН отвечает за поиск и удаление объемных повреждений во всем геноме, независимо от его функционального состояния, используя для первичного распознавания места повреждения комплексы фактора XPC [1]. Актуальной как для фундаментальных, так и для прикладных исследований остается разработка подходов, нацеленных на исследование и сравнение эффективности протекания репарации объемных повреждений в живых клетках (ex vivo)
Sign-in/Register to view highlights & summary Talk to us
Join us for a 30 min session where you can share your feedback and ask us any queries you have
Schedule a callDisclaimer: All third-party content on this website/platform is and will remain the property of their respective owners and is provided on "as is" basis without any warranties, express or implied. Use of third-party content does not indicate any affiliation, sponsorship with or endorsement by them. Any references to third-party content is to identify the corresponding services and shall be considered fair use under The CopyrightLaw.
