餵食Lactobacillus casei 01及其胞外多醣對1,2-二甲基聯胺誘導F344大鼠結腸癌前病變之影響

Abstract

結腸直腸癌在台灣是主要死亡原因之一。大約有70%的結腸直腸癌成因與飲食有關。乳酸菌會被用於癌症化學預防的研究，可能是因為它具有抗癌與抗腫瘤的活性。而乳酸菌對宿主有益之功效，部分原因應與其胞外多醣 (exopolysaccharides, EPS) 的生理活性有關。吾人以Lactobacillus casei 01的EPS為素材，從體外抗癌細胞增生、抗基因毒性試驗，探討其抗細胞毒性的潛力；再利用化學致癌劑-1,2-二甲基聯胺 (1,2-dimethylhydrazine, DMH) 誘導體內動物模式，探討其對結腸癌前病變的影響。最後研究餵食L. casei 01及EPS對DMH誘導大鼠結腸癌前病變之基因表現圖譜影響。 首先研究L. casei 01細胞區分物 (熱致死細胞、粗細胞壁及胞內液) 與EPS對人類結腸癌細胞株HT-29增生及腸道上皮細胞intestine 407細胞生長的影響。結果顯示EPS抗結腸癌細胞HT-29增生較細胞區分物顯著，且不會影響腸道上皮細胞intestine 407的生長。進一步研究，發現50和100 μg/mL的EPS可抑制結腸癌細胞HT-29增生，低濃度 (5-50 μg/mL) 的EPS不會抑制人類正常腸道細胞intestine 407的生長。再經由分段預培養試驗 (section-preincubation test) 和彗星分析法去探討EPS可能的抗細胞毒性機制，並評估EPS抑制4-硝基喹啉氧化物 (4-Nitroquinoline 1-oxide, 4NQO) 造成人類腸道細胞intestine 407 DNA損傷的情形。結果發現10-50 μg/mL的EPS可提升intestine 407細胞存活率。EPS可降低4NQO造成的細胞DNA損傷情形，其中以50 μg/mL的濃度效果最顯著 (p < 0.05)。由結果顯示L. casei 01的EPS具有抗細胞毒性，其主要抗4NQO之機制為阻擋效 (blocking effect) 應，此EPS亦有生物抗細胞毒性作用 (bioanticytotoxic effect)。 在體內動物結腸癌模式中，探討L. casei 01及EPS對大鼠糞便菌相、血清脂質濃度、抗氧化酵素與組織脂質過氧化物例如組織硫巴比妥酸反應物質 (thiobarbituric acid reactive substances, TBARS) 的影響以及它們抑制F344大鼠產生結腸癌前病變的能力。大鼠分為4組:第1組為控制組，第2組、第3組和第4組每週皮下注射1,2-二甲基聯胺 (1,2-dimethylhydrazine, DMH)，1週1次 (20 mg/kg b w)，共進行12週。此外，在實驗期間，第3組大鼠管餵L. casei 01懸浮液 (1010 cfu/10 mL/ kg bw/2 d)，第4組大鼠則管餵EPS (100 mg/10 mL/ kg bw/2 d)。大鼠在12週後犧牲，結果發現攝食L. casei 01會使DMH組大鼠減少丙胺酸轉胺酵素 (alanine aminotransferase, ALT) 活性及三酸甘油酯濃度。DMH組大鼠攝食L. casei 01可提升超氧歧化酶 (superoxide dismutase, SOD) 活性並降低麩胱甘肽還原酶 (glutathione reductase, GRd) 和麩胱甘肽過氧化酶 (glutathione peroxidase, GPx) 的濃度。此外，DMH+L. casei 01組大鼠的糞便中staphylococci、Escherichia coli和total coliforms的菌數皆低於控制組。注射DMH又同步餵食L. casei 01或EPS可以顯著提升糞便中乳酸桿菌和雙叉桿菌菌數。再者，DMH會導致大鼠血清及組織中TBARS的增加，而L. casei 01和EPS可抑制血清、肝臟、腎臟和結腸中TBARS的生成。組織切片結果顯示L. casei 01及EPS可減少DMH誘導而產生的結腸黏膜層病灶。 最後，利用基因組技術去探討餵食L. casei 01及EPS 和對DMH誘導之大鼠結腸癌前病變的基因表現和基因組改變的影響。將DMH、DMH+EPS和DMH+L. casei 01組的RNA和控制組的雜交在4×44K全大鼠微陣列 (whole rat microarray)，並且以即時定量聚合酶連鎖反應 (real-time quantitative PCR) 確認所選擇的基因。以IPA和DAVID 軟體分析完成微陣列數據的功能性分析。微陣列基因表現分析結果顯示在DMH、DMH+EPS和DMH+L. casei 01組中皆有複雜的基因表現變化情形，涉及許多生化路徑的調控。功能性分析顯示這些基因調控對刺激物的反應、轉錄作用、發炎反應、調節免疫、細胞程序和細胞凋亡。由基因表現量分析的結果顯示經DMH誘導的大鼠餵食EPS或L. casei 01可能會提升抑癌基因表現量以及抑制致癌基因表現量。SGK1的基因表現有助於腸道腫瘤的生成，但在DMH、DMH+EPS和DMH+L. casei 01組中均呈現下降的趨勢，是因為SGK1參與的結腸直腸癌訊息傳遞路徑可能被其他SGK同功異構型或蛋白質激酶B/Akt異構物執行。