Abstract
ATP-dependent Lon protease of Escherichia coli (EcLon), which belongs to the superfamily of AAA+ proteins, is a key component of the cellular proteome quality control system. It is responsible for the cleavage of mutant, damaged, and short-lived regulatory proteins that are potentially dangerous for the cell. EcLon functions as a homooligomer whose subunits contain a central characteristic AAA+ module, a C-terminal protease domain, and an N-terminal non-catalytic region composed of the actual N-terminal domain and the inserted α-helical domain. An analysis of the N domain crystal structure suggested a potential involvement of residues E34, K35, and R38 in the formation of stable and active EcLon. We prepared and studied a triple mutant LonEKR in which these residues were replaced with alanine. The introduced substitutions were shown to affect the conformational stability and nucleotide-induced intercenter allosteric interactions, as well as the formation of the proper protein binding site.
Highlights
ААА+-протеазы – высокоселективные ферменты, основными особенностями которых являются сопряжение протеолитической активности с гидролизом АТР и процессивный характер гидролиза белковых мишеней, в результате которого образуются исключительно низкомолекулярные продукты (5–15 аминокислотных остатков, а.о.) [13,14,15]
АТР-азную активность тестировали по накоплению во времени неорганического фосфата в реакции гидролиза АТР в 50 мМ Tрис-HCl-буфере, pH 8.1, содержащем 200 мМ NaCl, 2.5 мМ ATP, 2.5 или 20 мМ MgCl2 и 0.1–1.0 мкМ фермент в отсутствие и при наличии β-казеина (1 мг/мл), при 37оС [48]
Эффективность восстановления АТР-азной активности LonEKR-1 при взаимодействии с белковым субстратом также оказалась заметно ниже, чем у интактной Lon-протеазы и формы LonEKR
Summary
Участие остатков E34, K35 и R38 N-домена в формировании функционально активной структуры Lon-протеазы Escherichia coli. РЕФЕРАТ АТР-зависимая Lon-протеаза Escherichia coli (ЕсLon), относящаяся к суперсемейству ААА+белков, является ключевым участником системы контроля качества клеточного протеома, в которой она отвечает за расщепление потенциально опасных для клетки мутантных, поврежденных и короткоживущих регуляторных белков. ВВЕДЕНИЕ ATP-зависимые Lon-протеазы (MEROPS: клан SJ, семейство S16) – ключевые участники системы контроля качества клеточных белков, обеспечивающей сохранность протеома во всех царствах природы. Их субъединицы включают АТР-азный (ААА+) модуль, образованный нуклеотидсвязывающим (NB) и α-спирализованным (H) доменами, протеазный (P) домен, представляющий собой серин-лизиновую пептидгидролазу, а также N-концевой или инсерционный некаталитический экстрадомен (ED) Основой для разделения ферментов Lon на подсемейства служат различия в окружении каталитически активных остатков серина и лизина протеолитических центров, а также локализация экстрадоменов, определяющая архитектуру АТР-азного компонента [7, 8, 24]. В семействе Lon-протеаз идентифицировано два типа протеолитических центров – тип РА, обнаруженный в Р-доменах ферментов самого крупного подсемейства LonA, объединяющего ферменты бактерий и эукариот [7, 8, 24, 25], и тип РВ, детектируемый в ферментах подсемейства LonB из архей [8, 26], а также малочисленного бактериального подсемейства LonC (рис. 1А) [27, 28]
Sign-in/Register to view highlights & summary Sign-in/Register to access full text options 
Free) 
Talk to us
Join us for a 30 min session where you can share your feedback and ask us any queries you have
Schedule a call
