二重標識蛍光プローブを用いたHLA-BアリルのリアルタイムPCR-SSP法の開発

Abstract

PCR-SSP法と二重標識蛍光プローブとを組み合わたリアルタイムPCR-SSP法は, ABIPRISM(TM)7700シーケンスディテクターを利用して, リアルタイムにPCR産物を測定することで, PCR-SSP増幅後の付加的操作なしに短時間でアリルが決定できるシステムである. 我々は, このシステムを利用することがもっとも困難と思われるHLA-Bアリルに応用し, その実用性と問題点について検討した. HLA-B抗原の特異性が既知の34試料を対象とし, 市販のSSPプライマーキットと我々が設計した7種類の二重標識蛍光プローブを利用して行った. すべてのサンプルは, PCR増幅を35回行うことでもっとも良好な反応態度を示した. プライマーの特異性から増幅が期待されるサンプルはすべてΔRn閾値以上で, 陰性は閾値未満であり, 偽反応はみられなかった. また, 各サンプルでもっとも弱かった陽性ΔRn値と強かった陰性ΔRn値の比は6. 18であり, 判定上問題となることはなかった. 今回開発したリアルタイムPCR-SSPHLA-Bタイピングシステムで判定されたアリルタイプはパネルDNAの血清学的特異性とまったく矛盾しなかった. また, DNA抽出からHLA-Bアリル同定までの過程を約2時間で終了することができた. この方法はPCR増幅から反応結果出力までの過程が自動化されるているので人為的ミスを最小限に抑えることができるものと考えられた.