Gene tagging systems for polymerase chain reaction based monitoring of bacteria released for biological control of weeds

Abstract

A prerequisite to release of any modified pathogen into the environment, regardless of origin, is a reliable method for it's absolute identification from other strains. Several techniques are available, including lacZY gene of Escherichia coli, moc gene of Pseudomonas fluorescens, green fluorescent protein, and lux gene. The latter has worked well for tracking plant pathogenic Xanthomonas campestris pv. campestris in cabbage fields. We describe in detail a newly developed polymerase chain reaction (PCR)-based genomic scheme utilizing a 0.52-kilobase (kb) fatty acid desaturase (DES) fragment of the unique tox-argK gene cluster of Pseudomonas syringae pv. phaseolicola for tagging pathogenic xanthomonads released for biological control of weeds. The fragment is inserted into pGX15, a cosmid clone containing a 10.3-kb EcoR1-HindIII fragment with pigG of the xanthomonadin gene of pIG102 to make pGXP6. A 10.8-kb fragment of pGXP6 is then inserted into pLAFR3 to make pLXP22. Finally, the marked strain is constructed by inserting the unique 0.52-kb DES fragment of P. syringae pv. phaseolicola into a XmaI site within the pigG transcriptional unit on chromosomal DNA using pLXP22 and marker exchange. Results show that DES-tagged strains of X. campestris pv. convolvuli are stable and easily identified by PCR. Une méthode fiable pour l'identification irréfutable d'une souche parmi d'autres est une condition préalable à son relâchement dans l'environnement, pour tout organisme pathogène modifié, peu importe son origine. Plusieurs techniques sont disponibles, y compris le gène lacZY de l'Escherichia coli, le gène moc du Pseudomonas fluorescens, la protéine fluorescente verte et le gène lux. Ce dernier a bien fonctionné pour le pistage de l'agent phytopathogène Xanthomonas campestris pv. campestris dans des champs de choux. Nous détaillons un procédé génomique nouvellement développé, basé sur la réaction en chaîne de la polymérase et utilisant un fragment de 0,52 kilobases (kb) de la désaturase des acides gras (DES) du groupe de gènes exclusif tox-argK du Pseudomonas syringae pv. phaseolicola pour marquer des xanthomonas pathogènes relâchés comme moyen de lutte biologique contre les mauvaises herbes. Le fragment est inséré dans le pGX15, un clone cosmide contenant un fragment EcoRI-HindIII de 10,3 kb avec le pigG du gène de xanthomonadine de pIG102, pour obtenir le pGXP6. Un fragment de 10,8 kb du pGXP6 est alors inséré dans le pLAFR3 pour obtenir le pLXP22. Finalement, la souche marquée est construite en insérant le fragment DES exclusif de 0,52 kb du P. syringae pv. phaseolicola dans un site XmaI à l'intérieur de l'unité de transcription pigG sur l'ADN chromosomique à l'aide du pLXP22 et par échange de marqueur. Les résultats montrent que les souches du X. campestris pv. convolvuli marquées avec le DES sont stables et facilement identifiées par réaction en chaîne de la polymérase.