Abstract

In the legume-Rhizobium interaction Nod factors emanating from rhizobia trigger a complex of specific responses in epidermis, pericycle and root cortex of the plant, thereby providing the basis for subsequent bacterial entry and organogenesis of root nodules. Since Nod factors are biologically active at pico-nanomolar concentrations and their activity depends on Nod factor structural features, it suggests the presence of high affinity receptors to these molecules. Genetic analysis of pea mutants allowed to identify genes that are essential for symbiosis development and among of them the PsSym10 and PsSym37. These genes are predicted to encode LysM-receptor-like kinases with LysM motifs in extracellular domain (LysM-RLKs). These proteins may be potential receptors to Nod factors. However experimental evidence of Nod factor binding to the putative receptors is needed to confirm the biochemical function of receptors. Mainly, it depends on the problems with receiving of membrane receptors. In this work the heterologous expression of SYM10 and SYM37 was conducted in bacterial cells. We have also optimized the conditions for recombinant proteins purification and obtained specific antibodies for next immunoenzyme analysis of two LysM-RLKs in legume plants.

Highlights

  • Симбиоз между бобовыми растениями и клубеньковыми бактериями приводит к образованию на корнях растений новых структур — корневых клубеньков, в которых бактерии фиксируют атмосферный азот, переводя его в доступную для растений форму

  • identify genes that are essential for symbiosis development

  • These genes are predicted to encode LysM-receptor-like kinases with LysM motifs in extracellular domain (LysM-RLKs)

Read more

Summary

МАТЕРИАЛЫ И МЕТОДЫ

Штаммы и плазмиды Для экспериментальной работы были использованы штаммы E. coli DH-5α (Stratagene, США), а также мутантный штамм С41 (Miroux and Walker, 1996), полученный на основе штамма BL21 (DE3) (Novagene, США). Продукты амплификации очищали с помощью набора GIAEX II Gel Extraction Kit (Qiagen, США) согласно инструкции производителя и клонировали либо непосредственно в плазмидный вектор pRSETb, либо предварительно субклонировали в векторе pBluescript KS +/–, согласно стандартным протоколам с использованием соответствующих эндонуклеаз рестрикции и Т4 ДНК-лигазы (MBI Fermentas, Литва). Для выделения рекомбинантного белка из нерастворимой фракции клеточного лизата осадки ресуспендировали в 1–5 мл буфера (8 М мочевина, 100 мМ Na-фосфат pH 8,0; 1 мМ ФМСФ), суспензию центрифугировали при 14000g 30 минут при 12 oС (Hettich Micro 22R, Германия) для удаления нерастворившегося материала. В качестве стартового буфера использовали буферный раствор того же состава, что для растворения белка, элюцию неспецифично связавшихся белков проводили в буфере аналогичного состава, но с рН 6,5, тогда как для элюции рекомбинантных белков использовали буфер — 8 М мочевина, 100 мМ Na-фосфат pH 4,0; 1 мМ ФМСФ. Собранные фракции анализировали с помощью денатурирующего электрофореза в полиакриламидном геле

Получение субклеточных фракций клубеньков и корней гороха
РЕЗУЛЬТАТЫ И ОБСУЖДЕНИЕ
Full Text
Published version (Free)

Talk to us

Join us for a 30 min session where you can share your feedback and ask us any queries you have

Schedule a call