Establishment of fluorogenic quantitative method for the measurement of the B-lymphocyte stimulator gene expression

Abstract

目的 研究建立人B细胞激活因子(BlyS)mRNA荧光定量检测方法,探讨正常人外周血单个核细胞(PBMC)中BlyS基因表达水平.方法基于TaqMan荧光探针技术,构建克隆载体pMD18-T-BlyS作为定量模板,在GeneAmp 5700型检测仪上,通过荧光强度达到一定阈值时的循环数来定量起始模板,以建立实时荧光定量逆转录聚合酶链反应(FQ-RT-PCR)方法;并对20名健康献血者外周血中BlyS表达进行检测.结果FQ-RT-PCR的动态检测范围为104～109拷贝/μg RNA(r≥0.996),内参三磷酸甘油醛脱氢酶的动态检测范围为103～108拷贝/μg RNA(r≥0.998);低值的批内、批间的重复性分别为17.7%和24.3%,高值的批内、批间的重复性分别为5.3%和8.1%;20名献血员健康外周血的PBMC中均有BlyS mRNA的表达,范围为5.5×104～4.9×105拷贝/μg,均值为(1.7±1.4)×105拷贝/μg.结论成功建立人BlyS基因表达FQ-PCR检测方法,检测结果定量准确可靠,可用于BlyS基因表达与自身免疫性疾病发病机制的关系研究。