Ege ve Akdeniz Bölgesi bağlarından izole edilen Botryosphaeriaceae türlerinin PCR-RFLP analizi

Abstract

Birçok bitki türünde lokal kuruma ve geriye ölümlere neden olan Botryosphaeriaceae funguslarının klasik tanısı oldukça zor ve zaman alıcıdır. Türlerin hızlı tanısı için türe özgü primerlerle PCR testi, RFLP (Restricted Fragment Length Polymorphism) ya da gen sekanslama gibi bazı moleküler yöntemlerin kullanılması gerekmektedir. Bu çalışma, Türkiye bağlarında şimdiye kadar tespit edilmiş bazı Botryosphaeriaceae familyası fungus türlerinin, PCR-RFLP yöntemi ile hızlı tanısına katkı sağlamayı amaçlamaktadır. Ege ve Akdeniz Bölgesi bağlarından izole edilmiş 4 farklı türe ait (Botryosphaeria dothidea, Diplodia seriata, Lasiodiplodia theobromae ve Neofusicoccum parvum) 25 izolatttan DNA ekstraksiyonları yapılmış, genomik DNA üzerindeki β-tubulin (TUB2) ve ITS bölgesinden tasarlanmış Botryosphaeriaceae cinslerine özgü bölgeler, polimeraz zincir reaksiyonlarıyla çoğaltılmıştır. Bu bölgeler beş farklı restriksiyon endonükleaz enzimiyle (AluI, BsaHI, MboI, RsaI, TaqI) kesilmiş, agaroz jeldeki (%2) bant profilleri incelenmiştir. Analizlerin sonuçlarına göre; cinse özgü primerlerle çoğaltılan bölge RFLP analizi için uygun olmamıştır. Ancak, β-tubulin bölgesinin bu türlerin ayrımı için en az iki farklı restriksiyon enzimiyle kesilmesi gerektiği ortaya çıkmıştır. BsaHI enzimi B. dothidea ve D. seriata’nın β-tubulin genini keserek, iki ayrı büyüklükte bant profili (B. dothidea: 250 ve 700 bp ve D. seriata: 400 ve 600 bp) oluşturmuştur. Ancak bu enzim L. theobromae ve N. parvum için ayırt edici bant verememiştir. Buna karşın TaqI enzimi de B. dothidea ve D. seriata‘yı ayırt edememiş ancak L. theobromae ve N. parvum’un β-tubulin genini 2 yerden keserek her bir tür için üç ayrı bant (L. theobromae: 200-400-800 bp ve N. parvum: 200-400-650 bp) meydana getirmiştir.