Effects of ICAT silencing in Wnt signaling pathway and NSC67657 induced cell differentiation of HL-60 cells

Abstract

目的探讨β-catenin相关蛋白1（ICAT）沉默对Wnt信号通路及甾醇类新药NSC67657诱导HL-60细胞单核系分化的影响。方法NSC67657诱导HL-60细胞分化，流式细胞术检测细胞表面分化抗原CD14的表达，检测细胞分化程度；构建慢病毒LV-ICAT-RNAi载体，感染HL-60细胞，采用荧光实时定量PCR和Western blot技术检测感染前后ICAT基因和蛋白表达情况，判断干扰效果；采用免疫共沉淀技术检测β-catenin与ICAT蛋白在细胞内的相互作用；采用Western blot技术分析NSC67657诱导非感染HL-60细胞（HL-60v组）和LV-ICAT-RNAi载体感染HL-60细胞（HL-60i组）前后Wnt/β-catenin通路下游靶点Cyclin D1、TCF-1和c-Jun的表达情况；NSC67657分别作用HL-60v组和HL-60i组细胞24 h，采用瑞氏染色、透射电子显微镜、流式细胞术观察细胞分化情况。结果10 µmol/L NSC67657可以诱导HL-60细胞向单核系分化，连续诱导5 d后，CD14+细胞比例为（92.30±5.14）%；HL-60i细胞ICAT mRNA表达（0.07±0.01）明显低于HL-60v组（1.00±0.08）（P=0.002）（平均敲减效率为93.2%），Western blot结果与PCR结果一致（P=0.001）；免疫共沉淀结果显示，ICAT与β-catenin蛋白在细胞分化前后都存在相互作用，药物诱导细胞分化后两者相互作用条带吸光度明显增加。药物作用HL-60i细胞Wnt信号通路下游靶蛋白Cyclin D1、TCF-1和c-Jun表达明显高于HL-60v组，但低于非药物处理组。NSC67657作用HL-60i细胞CD14+细胞比例为（8.33±3.14）%，明显低于HL-60v组的（19.08±4.73）%，但仍高于非药物处理非感染HL-60细胞组（0.60±0.03）%（F=119.24，P=0.010），细胞形态和超微结果符合细胞表面分化抗原检测结论。结论ICAT蛋白参与了NSC67657诱导HL-60细胞的单核系分化，Wnt/β-catenin信号通路可能起到桥梁作用。