Effect of the Substrate Structure and Metal Ions on the Hydrolysis of Undamaged RNA by Human AP Endonuclease APE1.

A A Kuznetsova,N A Kuznetsov,O S Fedorova,D S Novopashina

doi:10.32607/actanaturae.10864

Abstract

Human apurinic/apyrimidinic (AP) endonuclease APE1 is one of the participants in the DNA base excision repair. The main biological function of APE1 is to hydrolyze the phosphodiester bond on the 5′-side of the AP sites. It has been shown recently that APE1 acts as an endoribonuclease and can cleave mRNA, thereby controlling the level of some transcripts. The sequences of CA, UA, and UG dinucleotides are the cleavage sites in RNA. In the present work, we performed a comparative analysis of the cleavage efficiency of model RNA substrates with short hairpin structures in which the loop size and the location of the pyrimidine–purine dinucleotide sequence were varied. The effect of various divalent metal ions and pH on the efficiency of the endoribonuclease reaction was analyzed. It was shown that site-specific hydrolysis of model RNA substrates depends on the spatial structure of the substrate. In addition, RNA cleavage occured in the absence of divalent metal ions, which proves that hydrolysis of DNA- and RNA substrates occurs via different catalytic mechanisms.

Highlights

Апуриновая/апиримидиновая эндонуклеаза чело века APE1 – один из наиболее изученных ферментов репарации ДНК [1]
Так как тушитель BHQ1 расположен на 3′-конце шпилек, то повышение интенсивности флуоресценции FAM для субстратов HP1–HP6, со держащих пару FAM/BHQ1, может быть обусловле но отдалением в пространстве остатков FAM и BHQ1 при образовании фермент-субстратного комплекса с 5′/3′-концевым участком
Кинетическая кривая накопления продуктов расщепления HP6 при взаимодействии с APE1 в присутствии 1 мM EDTA и 5 мM CaCl2, [РНК] = 1 мкM

Summary

ЭКСПЕРИМЕНТАЛЬНЫЕ СТАТЬИ

РЕФЕРАТ Апуриновая/апиримидиновая эндонуклеаза человека APE1 – один из участников системы эксцизионной репарации оснований ДНК. Расщепление РНК происходит в отсутствие ионов двухвалентных металлов, что свидетельствует об изменении каталитического механизма, установленного для реакции гидролиза ДНК-субстратов. Что APE1 вызывает деграда цию цепи РНК в дуплексах ДНК-РНК, т.е. Действительно, РНК-расщепляющая активность APE1 наблюдалась и при 10 мМ EDTA, и в присутствии ионов Mg2+, Ca2+ и Mn2+. Анализ активности данных мутантных форм APE1 по отношению к модельным РНК- и ДНК-субстратам показал, что большинство перечисленных остатков, критических для гидролиза AP-сайта в двухцепочечной ДНК, важны также для осуществления эн дорибонуклеазной активности. Содержащие белок APE1, диализовали в буфере 20 мМ HEPES-NaOH, pH 7.5, 1 мМ EDTA, 1 мМ дитиотреит, 250 мМ NaCl, 50% гли церин и хранили при -20°С. Флуоресцентное титрование Флуоресцентное титрование было выполне но на флуориметре Cary Eclipse Fluorescence

Нуклеотидная последовательность

РЕЗУЛЬТАТЫ И ОБСУЖДЕНИЕ

Эндорибонуклеазная активность

Субстрат Продукты эндорибонуклеазной реакции

ЭКСПЕРИМЕНТАЛЬНЫЕ СТАТЬИ A