Dynamic changes of intracellular calcium in osteoblast-like cells: effects on dye coupling

Abstract

Toxic effects of metal ions released from enossal implant materials on bone cells may partly arise from toxic elevations of free intracellular calcium concentration ([Ca2+]i). To analyzes such potential effects of elevated [Ca2+]i on the coupling of bone cells mediated by Cx43 gap junctions, Fura-2 loaded rat osteoblast-like (ROB) cells were stimulated by different procedures to undergo dynamic changes of [Ca2+]i. Ca2+ dynamics were correlated with data of corresponding experiments in which the spread of Lucifer Yellow had been investigated. After treatment with 0.5 mM ouabain (n = 137) [Ca2+]i slowly increased from about 100 nM to ≤ 150 nM in 90 % of the cells, while in 10 % repetitive peak-like elevations to ≤ 500 nM occurred. The incidence of dye coupling decreased from 94 % (control) to 75 %. Superfusion with sodium-free solution containing 0.5 mM ouabain (n = 290) elicited initial peak-like increases in [Ca2+]i to ≤ 500 nM in 41 % of the cells, whereas in 59 % of the cells [Ca2+]i was elevated to ≤ 170 nM. Concomitantly, dye coupling was reduced to 49 %. Application of 2 μM A23187 (n = 345) gave rise to an immediate [Ca2+]i peak ranging between 300 and 2000 nM followed by a sustained [Ca2+]i elevation in 99 % of the cells. The initial peak occurred also in nominally Ca2+ free solution, demonstrating pronounced depletion of intracellular calcium stores, which was sufficient to uncouple ≥ 90 % of the cells. Considering that elevated [Ca2+]i is the primary parameter leading to uncoupling, a minute-lasting elevation of [Ca2+]i to ≤ 500 nM was deduced from these experiments to be sufficient for uncoupling bone cells within their extended networks. Dynamische Änderungen der intrazellulären Calciumkonzentration in Osteoblast-ähnlichen Zellen: Wirkungen auf die Farbstoffkopplung Toxische Wirkungen von Metallionen aus enossalen Implantaten auf Knochenzellen können z. T. auf kritische Erhöhungen der intrazellulären freien Ca2+-Konzentration ([Ca2+]i) zurückgeführt werden. Um solche möglichen Effekte zu untersuchen, wurden in der vorliegenden Arbeit Wirkungen der [Ca2+]i auf die Kopplung von Knochenzellen über CY×43 gap junctions analysiert. Fura-2 beladene Osteoblast-ähnliche Zellen aus Schädelknochen der Ratte (ROB) wurden dynamischen Änderungen der [Ca2+]i unterzogen, die mit verschiedenen Strategien erzwungen wurden. Diese Ca2+ Änderungen wurden mit der Ausbreitung des Farbstoffs Lucifer Yellow (nach Mikroinjektionen in eine Zelle) in gekoppelte Nachbarzellen korreliert. Nach Zugabe von 0.5 mM Ouabain (n = 137) stieg die [Ca2+]i in 90 % der Zellen langsam von etwa 100 nM auf ≤ 150 nM an, während in 10 % der Zellen wiederholt auftretende steile Anstiege auf ≤ 500 nM zu beobachten waren. Die Wahrscheinlichkeit der Farbstoffkopplung nahm von 94 % (Kontrolle) auf 75 % ab. Das Überspülen mit Natrium-freier Lösung, die 0.5 mM Ouabain (n = 290) enthielt, führte zur Auslösung von steilen Anstiegen der [Ca2+]i auf ≤ 170 nM (41 % der Zellen), wohingegen sich in 59 % der Zellen die [Ca2+]i auf ≤ 170 nM erhöhte. Gleichzeitig verringerte sich die Farbstoffkopplung auf 49 %. Die Applikation von 2 μM A23187 (n = 345) induzierte in 99 % der Zellen einen raschen Anstieg der [Ca2+]i auf 300 bis 2000 nM, auf den eine anhaltende Erhöhung der [Ca2+]i folgte. Der anfängliche schnelle Ca2+-Anstieg trat auch in Ca2+-freier Lösung auf, was auf eine weitgehende Leerung der intrazellulären Calcium-Speicher hindeutet. Auch dieser transiente [Ca2+]i-Anstieg konnte ≥ 90 % der Zellen entkoppeln. Die Ergebnisse zeigen insgesamt, daß eine etwa einminütige Erhöhung der [Ca2+]i auf ≤ 500 nM ausreichend war, um eine Entkopplung der Knochenzellen innerhalb ihres ausgedehnten Netzwerks zu bewirken.