Differentiation of European and North American genotypes of Phytophthora ramorum by real-time polymerase chain reaction primer extension

Abstract

Phytophthora ramorum, the organism responsible for sudden oak death, causes severe damage to oak (Quercus spp.) and tanoak (Lithocarpus densiflorus) trees in California and Oregon. There are now >100 host plants that can be affected by this pathogen in nurseries and in the wild in Europe and North America. Molecular diagnosis and genotyping are important tools to monitor and prevent spread of this pathogen, to enforce quarantines, and to support eradication programs. By amplifying and sequencing DNA in a worldwide panel of strains of P. ramorum, we discovered single-nucleotide polymorphisms (SNP) in two genes (β -tubulin and cellulose binding elicitor lectin (CBEL)) that differ in the European and the North American P. ramorum isolates. Using these SNPs in diagnostic assays and distinguishing among strains of different geographic origins, we developed primer extension assays in real-time polymerase chain reaction using allele-specific oligonucleotides. All European isolates genotyped were homozygous for the SNP at position 279 in the β -tubulin gene (β- tub279 ; G/G) but heterozygous at position 858 (β- tub858 ; A/G). By contrast, all the California isolates were heterozygous for β -tub279 (T/G) but homozygous for β -tub858 (A/A). For CBEL, all European isolates were heterozygous for the SNPs at position 245 (CBEL245 ; G/C) and 412 (CBEL412 ; G/A), but the California samples were homozygous at both SNP loci CBEL245 (G/G) and CBEL412 (G/G). This assay was also used directly on DNA extracted from the ELISA lysates from field samples collected in British Columbia in 2005 by the Canadian Food Inspection Agency. Although most samples had the North American DNA profiles, there were several samples with the European profiles from the nurseries. This finding could provide information on the biology, epidemiology, etiology, host range, and populations of P. ramorum from North America and Europe and provide useful tools in P. ramorum surveys. Key words: primer extension, β- tubulin, CBEL, genotyping, allele specific oligonucleotide, SybrGreen, mating type, PCR-ASO. Le Phytophthora ramorum, l'organisme responsable de l'encre des chênes rouges ou aussi appelé la mort subite du chêne, cause de sérieux dommages aux chênes (Quercus spp.) et lithocarpes (Lithocarpus densiflorus) de la Californie et de l'Oregon. Il y a maintenant plus de 100 espèces de plantes hôtes pouvant être infectées par cet agent pathogène en Europe et en Amérique du nord, autant en pépinière qu'en nature. Le diagnostic moléculaire et le génotypage sont des outils permettant de répertorier et de prévenir la propagation de cet agent pathogène, de renforcer les mesures de quarantaines et de supporter les programmes d'éradication de la maladie. En amplifiant et en séquençant l'ADN d'une collection mondiale du P. ramorum, nous avons découvert des polymorphismes dans deux gènes (β -tubuline et CBEL « cellulose binding elicitor lectin ») pouvant différencier les isolats européens des nord- américains du P. ramorum. En utilisant ces SNP dans des tests diagnostics et en différenciant les souches de diverses origines géographiques, nous avons utilisé la méthode d'extension des amorces avec la réaction de polymerisation en chaîne (PCR) en temps-réel et des oligonucleotides spécifiques d'allèle. Tous les isolats européens génotypés étaient homozygotes pour la β- tubuline pour le SNP β -tub279 (G/G), mais hétérozygotes pour β -tub858 (A/G). Par ailleurs, tous les isolats californiens étaient hétérozygotes pour β -tub279 (T/G), mais homozygotes pour β -tub858 (A/A). Pour ce qui est de CBEL, tous les isolats européens étaient hétérozygotes pour CBEL245 (G/C) et CBEL412 (G/A), mais les échantillons de Californie étaient homozygotes aux deux SNP loci, CBEL245 (G/G) et CBEL412 (G/G). Ce test a aussi été utilisé directement sur des échantillons environnementaux d'ADN extraits de lysats d'ELISA provenant de pépinières de Colombie-Britannique dans une enquête de l'Agence canadienne d'inspection des aliments réaliseé en 2005. Presque tous ces échantillons présentaient un profile nord américain contre quelques-uns présentant un profil européen. Cette découverte est importante car elle fournit de l'information sur la biologie, l'épidémiologie, l'étiologie, la diversité d'hôtes et les populations du P. ramorum d'Europe et d'Amérique du nord. Mots-clés : extension des amorces, β- tubuline, CBEL, génotypage, oligonucléotide spécifique d'allèle, SybrGreen, type sexuel, PCR-ASO.