Development of an Agrobacterium tumefaciens -mediated gene disruption method for Sclerotinia sclerotiorum

Abstract

An efficient Agrobacterium tumefaciens -mediated gene-disruption method was developed for Sclerotinia sclerotiorum. As proof of principle, a transformation vector containing the full-length sequence of the glyoxylate cycle malate synthase gene (mls1) disrupted by gene cassette encoding resistance to hygromycin B was used as a test case for gene disruption. Gene disruption (knockout) mutants were generated by introducing the disruption construct into ascospores, selecting transformants on hygromycin-amended medium, and by rigorous hyphal tip purification of transformants. This procedure yielded stable, hygromycin-resistant transformants, and DNA blot hybridization analysis demonstrated a high frequency of gene disruption by homologous recombination. Defective function of the glyoxylate cycle and loss of pathogenicity in the knockout mutants was also demonstrated. Key words: Agrobacterium tumefaciens -mediated transformation, gene disruption, glyoxylate cycle, malate synthase, pathogenicity, Sclerotinia sclerotiorum. Une méthode de mutation dirigée pour Sclerotinia sclerotiorum à l'aide d' Agrobacterium tumefaciens a été développée. Afin d'en démontrer le principe, un vecteur de transformation contenant la totalité du gène de la malate synthase du cycle du glyoxylate (mls1) inactivé par une cassette de gènes codant la résistance à l'hygromycine B a été utilisé à titre d'essai type de disruption génique. Des mutants dont le gène a été inactivé (knockout) ont été générés par la transformation du vecteur dans des ascospores, suivie d'une sélection sur milieu contenant de l'hygromycine et une purification rigoureuse de l'extrémité des hyphes des transformants putatifs. Cette procédure a permis la sélection de mutants dont la résistance est stable. L'hybridation de l'ADN génomique des mutants a montré une fréquence élevée d'inactivation de mls1 par recombinaison homologue. Le mauvais fonctionnement du cycle du glyoxylate ainsi que la perte de pathogénicité des mutants knockout a aussi été démontrée. Mots-clés : transformation par Agrobacterium tumefaciens, mutation dirigée, cycle du glyoxylate, malate synthéase, pathogenèse, Sclerotinia sclerotiorum.