Abstract
Aim: To develop a highly sensitive real-time polymerase chain reaction (PCR) system for detection of somatic mutations in 542 and 545 codons of exon 9 and 1047 codon of exon 20 of PIK3CA gene comprising more than 80% of all somatic mutations in this gene for application on histological material without macroand microdissection, and to analyze associations between these mutations and clinical and pathological characteristics of breast tumors. Materials and methods: The Allele-specific real-time PCR method with signal detection by TaqMan probes was used. For determination of its analytical sensitivity, plasmids carrying the mutations studied were constructed by standard genetic engineering methods using mutagenesis. DNA samples carrying various mutated/wild type DNA ratios (5.0; 2.0; 1.0; 0.5, 0.25%) were prepared. Results: Multiplex allele-specific real-time PCR method for detection of most common mutations in PIK3CA gene: p.E542K c.1624G>A, p.E545K c.1633G>A, p.H1047R c.3140A>G, p.H1047L c.3140A>T – was developed and optimized. Analytical sensitivity of mutation detection comprised 0.5% for p.E542K and 0.25% for p.E545K, p.H1047R and H1047L enzyme. Conclusion: The method developed for detection of somatic mutations in PIK3CA gene is sufficiently sensitive, specific and efficient, that allows to propose it for a routine screening in clinical diagnostic laboratories for evaluation of disease prognosis and monitoring of response to therapy and its modification.
Highlights
Цель – разработать высокочувствительную систему для выявления соматических мутаций в кодонах 542 и 545 экзона 9 и в кодоне 1047 экзона 20 гена PIK3CA, составляющих более 80% всех соматических мутаций этого гена, с использованием полимеразной цепной реакции (ПЦР) в режиме реального времени для работы с гистологическим материалом без проведения макро- и микродиссекции и произвести анализ ассоциаций этих мутаций с клиническими и морфологическими характеристиками опухолей молочной железы
На первом этапе анализа для валидации разработанного метода мы параллельно проанализировали 334 образца дезоксирибонуклеиновой кислоты (ДНК), выделенной из парафиновых блоков опухолей, удаленных хирургическим методом у больных раком молочной железы III– IV стадий, с применением разработанного нами метода Аллель-специфичная полимеразная цепная реакция (АС-ПЦР) и прямого секвенирования по Сенгеру
ConclusionThe method developed for detection of somatic mutations in PIK3CA gene is sufficiently sensitive, specific and efficient, that allows to propose it for a routine screening in clinical diagnostic laboratories for evaluation of disease prognosis and monitoring of response to therapy and its modification
Summary
Фрагменты ДНК, включающие область 542, 545 и 1047 кодонов, для конструирования стандартных образцов амплифицировали с помощью праймеров, приведенных в табл. 1, в следующих условиях: реакционная смесь ПЦР объемом 50 мкл содержала буфер для Taq-полимеразы (65 мМ Tris-НСl; рН 8,9; 16 мМ (NH4)2SO4; 0,05% Tween 20; 3,5 мМ MgCl2), 0,2 мМ дНТФ, 50 нг геномной ДНК, выделенной из парафиновых блоков опухолей молочной железы и валидированной секвенированием по Сенгеру, 1 е.а. Фрагменты ДНК, включающие область 542, 545 и 1047 кодонов, для конструирования стандартных образцов амплифицировали с помощью праймеров, приведенных в табл. 1, в следующих условиях: реакционная смесь ПЦР объемом 50 мкл содержала буфер для Taq-полимеразы (65 мМ Tris-НСl; рН 8,9; 16 мМ (NH4)2SO4; 0,05% Tween 20; 3,5 мМ MgCl2), 0,2 мМ дНТФ, 50 нг геномной ДНК, выделенной из парафиновых блоков опухолей молочной железы и валидированной секвенированием по Сенгеру, 1 е.а. Амплификацию проводили в амплификаторе Терцик (ДНК-технология) согласно следующей программе: 3 мин при 95 °С начальной денатурации, далее 50 циклов: 10 с при 95 °С для денатурации, 10 с при 60 °С для гибридизации праймеров, 20 с при 72 °С для элонгации. Продукты амплификации с праймерами 542-UC/545-RC (длиной 199 п.н.) и PIK47-clU/ PIK47-clR (длиной 213 п.н.) гидролизовали эндонуклеазами рестрикции Hind III и EcoRI («Сибэнзим», Россия) и лигировали с вектором pBluescript II SK (+), гидролизованным теми же Филипенко М.Л., Шамовская Д.В., Оськина Н.А., Оскорбин И.П., Храпов Е.А., Овчинникова Л.К., Герштейн Е.С., Кушлинский Н.Е
Sign-in/Register to view highlights & summary Sign-in/Register to access full text options 
Talk to us
Join us for a 30 min session where you can share your feedback and ask us any queries you have
Schedule a callDisclaimer: All third-party content on this website/platform is and will remain the property of their respective owners and is provided on "as is" basis without any warranties, express or implied. Use of third-party content does not indicate any affiliation, sponsorship with or endorsement by them. Any references to third-party content is to identify the corresponding services and shall be considered fair use under The CopyrightLaw.
