Abstract

The aim of the study was to develop and assess the efficacy of a method for Lujo virus RNA detection in clinical and biological samples using one-step real-time RT-PCR.Materials and methods. In order to select the conservative regions of the genome, we utilized the available in GenBank database Lujo virus sequences (https://www.ncbi. nlm.nih.gov/genbank) aligned in BioEdit 7.2.5 software package ( (IbisBiosciences, USA). To conduct one-round RTPCR, reverse transcriptase and TaqF-polimerase were used. Recombinant Escherichia coli strain, XL1-Blue, containing pGEM-T plasmid with inserted synthetically-generated fragment of the virus genome, was produced to make positive control sample (PCS). Constructed recombinant plasmids were used for creating RNA-containing PCS with protective protein shell of MS2-phage. Determination of specificity of the developed method was performed with the help of control panel of RNA and DNA of 23 viral strains related to 10 families; the sensitivity – the panel of biological samples artificially contaminated with PCS. Further testing was carried out at the premises of laboratory of the Russian-Guinean Center for Epidemiology and Prevention of Infectious Diseases (Kindia, Republic of Guinea) on 265 blood sera from practically healthy persons, 110 blood sera of cattle, 83 suspensions of ticks, and 165 suspensions of organs of small mammals collected in the territory of Guinea.Results and discussion. Two conservative polymerase gene fragments have been chosen as targets for Lujo virus RNA detection using RT-PCR. The combination of primers and probes has been experimentally selected, optimum composition of reaction mixture for PCR and mode of RT-PCR set-up established, as well as control samples C+, internal control, positive control sample developed. Sensitivity of the proposed method is 5·103 GE /ml, specificity – 100 %.

Highlights

  • Апробация разработанного способа выявления РНК вируса Луйо методом обратную транскрипцию и ПЦР (ОТ-ПЦР)-РВ проведена на пробах клинического и биологического материала, собранных на территории Гвинейской Республики, являющейся эндемичной по лихорадке Ласса, возбудитель которой относится к тому же семейству, что и вирус Луйо

  • Таблица 3 / Table 3 Результаты исследования проб клинического и биологического материала, собранного на территории Гвинейской Республики, с помощью разработанного способа выявления РНК вируса Луйо методом ОТ-ПЦР-РВ Results of testing of clinical and biological samples collected in the territory of the Republic of Guinea applying the developed method for Lujo virus RNA detection using real-time RT-PCR

  • Разработка методики выявления РНК вируса Луйо с использованием полимеразной цепной реакции с гибридизационнофлуоресцентной детекцией

Read more

Summary

Оригинальные статьи

Цель – разработка и оценка эффективности способа выявления РНК вируса Луйо в пробах клинического и биологического материала с помощью одношаговой ОТ-ПЦР с учетом результатов в режиме реального времени. Для подбора консервативных участков генома использовали доступные в базе данных GenBank (https://www.ncbi.nlm.nih.gov/genbank) последовательности вируса Луйо, выровненные с использованием программного пакета BioEdit 7.2.5 (IbisBiosciences, США). Для проведения ОТ-ПЦР в одном раунде использовали обратную транскриптазу и TaqF-полимеразу. Для создания положительного контрольного образца (ПКО) получали рекомбинантный штамм Escherichia coli XL1-Вlue, содержащий плазмиду pGEM-T со встроенным синтетически полученным фрагментом генома вируса. Сконструированные рекомбинантные плазмиды использовали для создания РНК-содержащего ПКО с защитной белковой оболочкой MS2-фага. Определение специфичности разработанного способа осуществляли с использованием контрольной панели РНК и ДНК 23 штаммов вирусов, относящихся к 10 семействам, чувствительности – панели биологических образцов, искусственно контаминированных ПКО. В качестве мишени для детекции РНК вируса Луйо методом ОТ-ПЦР выбраны два консервативных фрагмента гена полимеразы.

Original articles
Материалы и методы
Семейство Family
Результаты и обсуждение
Подлежит учету Liable for registration
Суспензии клещей Tick suspensions
Full Text
Published version (Free)

Talk to us

Join us for a 30 min session where you can share your feedback and ask us any queries you have

Schedule a call