Abstract
Padronizou-se um método de reação em cadeia da polimerase (PCR) multiplex para detecção de Escherichia coli O157:H7 e avaliou-se a eficiência da PCR e de um método de cultivo convencional em placas na detecção desse patógeno experimentalmente adicionado em leite estéril e em leite cru com baixa contagem bacteriana total (média de 4,01 x 10³ UFC/ml) e com alta contagem bacteriana (média de 2,10 x 10(6) UFC/ml). Foram padronizadas duas reações de PCR com o uso dos primers: "A" (RfbF; RfbR e FLICh7F/FLICh7R) e "B" (SLT-IF/SLTIR e SLT-IIF/SLT-IIR). A detecção de E. coli O157:H7 (1UFC/ml) a partir do leite estéril e do leite cru com baixa contaminação bacteriana foi possível quando se utilizou o método de contagem em placas e a PCR. A sensibilidade dos dois métodos foi menor quando se testou o leite cru com alta contaminação microbiana, sendo o método convencional mais sensível. Os resultados indicam que a presença de outros microrganismos, em alta quantidade no leite, dificulta a detecção de E. coli O157:H7 pelos métodos utilizados.
Highlights
Escherichia coli O157:H7 é um sorotipo de E. coli pertencente ao grupo EHEC (E. coli enterohemorrágicas)
Uma vez que ambos os métodos de extração de DNA permitiram amplificação dos fragmentos específicos após o cultivo em caldo EC, adotouse o método de lise térmica devido à sua simplicidade e rapidez
Simultaneous detection of Escherichia coli O157:H7, Salmonella and Shigella in apple cider and produce by a multiplex PCR
Summary
O trabalho foi desenvolvido nos Laboratórios de Microbiologia do Leite e de Genética Molecular da Embrapa Gado de Leite em Juiz de Fora, Minas Gerais. Para cultura em meio líquido (caldo de enriquecimento), o DNA foi extraído pelo método fenol-clorofórmio (Jersek et al, 1996) e pelo método de lise térmica (Nunes et al, 1999). Essas mesmas diluições foram utilizadas na avaliação da sensibilidade da PCR para detectar E. coli O157:H7 inoculada experimentalmente em leite esterilizado e leite cru com diferentes contagens de microrganismos contaminantes (baixa e alta contaminação definidas pela contagem bacteriana total - CBT) após enriquecimento em caldo EC. Incubaram-se os frascos por 24h/35oC e foi realizada a extração de DNA de 1ml da cultura de cada frasco pelo método de lise térmica (Nunes et al, 1999) e pelo método de fenol-clorofórmio (Jersek et al, 1996). O DNA obtido foi usado na PCR multiplex (reação “A”) para determinar o menor número de bactérias presentes no leite que o método é capaz de detectar. O leite cru com baixa contaminação (CBT inferior a 1 x 104UFC/ml) utilizado foi obtido na Embrapa Gado de Leite, Coronel Pacheco, MG, e o de alta contaminação microbiana (CBT maior que 1 x 106UFC/ml), no Instituto de Laticínios Cândido Tostes/EPAMIG, Juiz de Fora, MG
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