Depletion of RUVBL2 in Human Cells Confers Moderate Sensitivity to Anticancer Agents

Mayumi Miyamoto Matsubara

doi:10.4172/1948-5956.1000306

Abstract

Background: Many anticancer agents kill cancer cells by inducing lethal damage in DNA, but the capacity of DNA repair of cells reduce the therapeutic efficacy of anticancer agents. RuvB-like (RUVBL) 2 is part of large protein complexes such as TIP60 and INO80 that are involved in chromatin remodeling and DNA damage responses and repair. Relatively few studies have investigated the role of RUVBL2 in the survival of cells after exposure to anticancer agents. Methods: We depleted RUVBL2 in human MRC5-SV cells by small interfering (si) RNA and assessed the sensitivity of the cells to chemotherapeutic anticancer agents including cisplatin (cisPt), 2’-deoxy-5-azacytidine (azadC), and mitomycin C (MMC), and to physical DNA-damaging agents including X-rays. Results: The knockdown efficiency with 10 nM siRUVBL2 was 80% on day 3 post-transfection, and knockdown (>65%) persisted on day 6. The cell growth slowed significantly due to depletion of RUVBL2 when compared to mock- and control siRNA-treated cells, indicating that RUVBL2 is essential for the proliferation of cells. The RUVBL2-depleted cells were moderately sensitive to cisPt, azadC, and X-rays. The increase in the sensitivity to MMC was marginal. Conclusion: Depletion of RUVBL2 in cells confers moderate sensitivity to anticancer agents and X-rays, presumably through partial impairment of the homologous recombination repair of DNA double-strand break intermediates formed directly or indirectly by anticancer agents or X-rays. Further studies are necessary to clarify the exact role of RUVBL2 in this process.

Highlights

れたが,DPC 生成量とアルデヒドの細胞毒性の間には有意な相関は認められなかった。また,アルデヒド処理直後には DSB 生成は起こらなかった。ICL については検出法が確立されていないことから,ICL 修復が欠損したヒトファンコニー貧血(FANC)細胞のアルデヒド感受性を調べた。FANC 細胞は,単純アルデヒドおよび飽和アルデヒドに対し高感受性を示したが,短鎖α,β-不飽和アルデヒドに対する感受性は弱く,長鎖α,β-不飽和アルデヒドには感受性を示さなかった。この結果は,修復欠損 CHO 細胞のアルデヒド感受性とよく一致し,アルデヒドが誘発する主要な致死損傷として ICL が強く示唆された。次に,DNA 損傷非依存的な細胞毒性について検討した。アルデヒドは,ペプチドやタンパク質と反応し付加体を形成する。これらの付加体形成は,ペプチドやタンパク質の機能を阻害し細胞毒性につながる。本研究では,CHO 細胞を LD10 濃度のアルデヒドで処理し, glutathione(GSH)の細胞内全濃度と thioredoxin [細胞質型 Trx1, ミトコンドリア型 Trx2] の酸化還元状態に対する影響を調べた。GSH 濃度は,アルデヒド処理により未処理の 38-72%に減少した。GSH 生合成阻害剤である buthionine sulphoximine を用いた比較実験では,同レベルの GSH 濃度低下で,細胞生存率が 70%に低下したことから,アルデヒドによる GSH 濃度低下は,細胞毒性誘発の共通メカニズムであることが示された。Trx1 については,短鎖α,β-不飽和アルデヒド(ACR, CRA, PTE)でチオール基の酸化(77-100%)が起こった。Trx 還元酵素阻害剤である auranofin を用いた比較実験では,同レベルの Trx1 酸化で,細胞生存率が 37%に低下したことから,Trx1 の酸化は,ACR, CRA, PTE の細胞毒性誘発の原因となることが示された。一方,いずれのアルデヒドでも,Trx2 の酸化は起こらなかった。また,ミトコンドリア膜電位や細胞内 ATP レベルも変化しなかった。本研究は,アルデヒドの細胞毒性誘発機構に,DNA 損傷依存的な機構と DNA 損傷非依存的な機構があることを明らかにした。さらに,DNA 損傷依存的な機構は,単純アルデヒドおよび飽和アルデヒドの細胞毒性誘発に重要であることを示した。一方,DNA 損傷非依存的な機構としては,GSH 濃度減少や Trx1 の酸化があり,長鎖および短鎖α,β-不飽和アルデヒドの細胞毒性誘発に重要であることを示唆した。これらの成果は,アルデヒドの細胞毒性誘発機構解明にとどまらず,アルデヒドが関与する様々な疾病の発病機構解明にも貢献すると考えられる。.
論文題目 Genetic and Biochemical Studies on the Cytotoxicity of Aldehydes (アルデヒドの細胞毒性に関する遺伝学的ならびに生化学的研究)
論文審査担当者主査教授井出博審査委員教授山本卓審査委員教授坂本敦

Summary

Introduction

れたが,DPC 生成量とアルデヒドの細胞毒性の間には有意な相関は認められなかった。また,アルデヒド処理直後には DSB 生成は起こらなかった。ICL については検出法が確立されていないことから,ICL 修復が欠損したヒトファンコニー貧血(FANC)細胞のアルデヒド感受性を調べた。FANC 細胞は,単純アルデヒドおよび飽和アルデヒドに対し高感受性を示したが,短鎖α,β-不飽和アルデヒドに対する感受性は弱く,長鎖α,β-不飽和アルデヒドには感受性を示さなかった。この結果は,修復欠損 CHO 細胞のアルデヒド感受性とよく一致し,アルデヒドが誘発する主要な致死損傷として ICL が強く示唆された。次に,DNA 損傷非依存的な細胞毒性について検討した。アルデヒドは,ペプチドやタンパク質と反応し付加体を形成する。これらの付加体形成は,ペプチドやタンパク質の機能を阻害し細胞毒性につながる。本研究では,CHO 細胞を LD10 濃度のアルデヒドで処理し, glutathione(GSH)の細胞内全濃度と thioredoxin [細胞質型 Trx1, ミトコンドリア型 Trx2] の酸化還元状態に対する影響を調べた。GSH 濃度は,アルデヒド処理により未処理の 38-72%に減少した。GSH 生合成阻害剤である buthionine sulphoximine を用いた比較実験では,同レベルの GSH 濃度低下で,細胞生存率が 70%に低下したことから,アルデヒドによる GSH 濃度低下は,細胞毒性誘発の共通メカニズムであることが示された。Trx1 については,短鎖α,β-不飽和アルデヒド(ACR, CRA, PTE)でチオール基の酸化(77-100%)が起こった。Trx 還元酵素阻害剤である auranofin を用いた比較実験では,同レベルの Trx1 酸化で,細胞生存率が 37%に低下したことから,Trx1 の酸化は,ACR, CRA, PTE の細胞毒性誘発の原因となることが示された。一方,いずれのアルデヒドでも,Trx2 の酸化は起こらなかった。また,ミトコンドリア膜電位や細胞内 ATP レベルも変化しなかった。本研究は,アルデヒドの細胞毒性誘発機構に,DNA 損傷依存的な機構と DNA 損傷非依存的な機構があることを明らかにした。さらに,DNA 損傷依存的な機構は,単純アルデヒドおよび飽和アルデヒドの細胞毒性誘発に重要であることを示した。一方,DNA 損傷非依存的な機構としては,GSH 濃度減少や Trx1 の酸化があり,長鎖および短鎖α,β-不飽和アルデヒドの細胞毒性誘発に重要であることを示唆した。これらの成果は,アルデヒドの細胞毒性誘発機構解明にとどまらず,アルデヒドが関与する様々な疾病の発病機構解明にも貢献すると考えられる。.

Results

Conclusion