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Abstract
Nesta revisão, foram discutidos os procedimentos para obtenção, manuseio e armazenamento de amostras biológicas úteis em testes moleculares. Métodos para triagem e detecção direta de mutações e polimorfismos genéticos foram apresentados. Os princípios, estratégias, aplicações e limitações de variações da reação em cadeia pela polimerase (PCR), tais como eletroforese em gel com gradiente de desnaturação (DGGE), polimorfismo de conformação de fita simples (SSCP), polimorfismo de tamanhos de fragmentos de restrição (RFLP), amplificação alelo oligonucleotídeo-específica (PCR-ASO), PCR em tempo real PCR, arranjos de DNA e outras técnicas moleculares, foram comentados.
Highlights
32 - Whitcombe D, Brownie J, Gillard HL, McKechnie D, Theaker J, Newton CR, Little S
A homogeneous fluorescence assay for polymerase chain reaction (PCR) amplicons
A análise do enorme conjunto de resultados gerados por esses métodos é dependente da Bioinformática que tornou-se uma ciência imprescindível no desenvolvimento da tecnologia molecular com a integração das ciências da saúde, biológicas e da computação
Summary
Para detecção no DGGE, os produtos da PCR são marcados com substâncias radioativas. Uma estratégia é o acoplamento seqüências ricas em GC em um dos oligonucleotídeos na PCR (GC clamp), conseqüentemente, mais mutações são detectadas por DGGE para diferentes finalidades. Com o aumento do número de domínios, a mobilidade diminui, por isto, a fração de mutações detectadas diminui com o aumento do tamanho do fragmento. O SSCP (Single-Strand Conformation Polymorphism) é um método de triagem de mutações que permite detectar alterações na mobilidade eletroforética de fitas simples de ácidos nuclécos em condições não-desnaturantes (Figura 3). Autorradiograma de produtos da PCR separados por DGGE para a triagem de mutações. Dos nucléicos formam estruturas secundárias em solução que dependem da composição/seqüência de bases e do tamanho da fita simples. Mudança em uma base na seqüência do ácido nucléico amplificado pela PCR pode ser detectada por SSCP.
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