Culture of rabbit bone marrow mesenchymal stem cells on porous silk fibroin scaffold in vitro

Abstract

目的 观察兔骨髓间充质干细胞复合多孔丝素蛋白体外培养情况,探讨多孔丝素蛋白适合细胞生长的孔径及作为支架材料的意义.方法取4周龄雄性新西兰大耳白兔4只,经戊巴比妥钠腹腔注射麻醉后,抽取骨髓5 ml/只,与3 m1肝素(625 U/ml)混匀.抗凝骨髓5 ml加入等量Hanks液混匀,以1份淋巴细胞分离液上面加2份稀释骨髓的比例离心,取有核细胞层,Hanks液洗2次,以3×106/ml细胞密度接种于50ml培养瓶,37℃,5%CO2,饱和湿度培养,48 h首次换液,以后2～3 d换液1次,均为全量换液.当原代细胞培养15～20 d,细胞占瓶的90%以上,消化、传代为1代,以后5～7 d传代1次.将传至3代的细胞接种于平均孔径为58 μm、78 μm、111 μm的丝素材料上,共培养8 d.倒置显微镜连续观察,并于第1 d、第4 d、第8 d取三种材料行扫描电镜、激光共聚焦显微镜观察生长情况.结果倒置显微镜观察,材料上细胞看不清,可见板底的细胞一天比一天多.扫描电镜上细胞材料均清晰,第1 d、第4 d、第8 d的标本显示细胞越来越多,并可见颗粒状、丝状基质物质.激光共聚焦显微镜是动态观察细胞,将细胞标记好后,复合在材料上,养在培养液中观察细胞的荧光强度,随着培养时间的增加荧光区越来越大.三种显微镜观察均显示细胞生长繁殖良好,形态、活性正常,111 μm孔径的材料尤为突出.结论多孔丝素蛋白具有很好的生物相容性、细胞吸附性和体内降解性,作为骨组织工程的支架材料具有一定的应用价值,但要选择其合适的孔径。