Construction of EZH2 Knockout Animal Model by CRISPR/Cas9 Technology

Abstract

背景与目的已有的研究证明CRISPR/Cas9（Clustered Regularly Interspaced Short Palindromic Repeats/CRISPR-associated 9）系统是一种能够在哺乳动物细胞中高效操作的新型基因编辑技术，应用人工设计的向导RNA（single-guide RNA, sgRNA）介导外源表达的Cas9蛋白与靶点DNA特异性结合以实现对基因组DNA的切割，被切割后的基因组DNA通过非同源重组或同源重组的方式进行修复，从而实现基因的敲除、或者外源基因的敲入等目标。本研究的目的是应用CRISPR/Cas9技术构建小鼠肺部EZH2基因敲除的动物模型。方法针对EZH2基因的编码区，设计两个靶向EZH2基因Exon3和Exon4的sgRNA，通过慢病毒包装、感染细胞、SURVEYOR assay等一系列体外实验，验证所设计的sgRNA的有效性。应用支气管插管的方式把慢病毒灌注到小鼠肺部，利用免疫组化方法和qRT-PCR进行检测。结果NIH-3T3细胞的体外实验结果验证了实验所设计的sgEZH2能够有效地在体外细胞系中介导Cas9切割靶DNA；小鼠支气管插管实验及肺部组织免疫组化和qRT-PCR方法检测EZH2基因敲除的效率，发现实验组小鼠肺部组织EZH2表达明显降低。结论本研究成功设计了两条能够敲除EZH2功能的sgRNA，并应用CRISPR/Cas9技术成功建立了肺部EZH2基因敲除的小鼠模型，为研究EZH2的功能和作用机制提供了有效的动物模型。