CONSTRUCTION OF A DNA-MICROARRAY FOR DIFFERENTIATION BETWEEN THE MAIN AND NON-MAIN SUBSPECIES AND BIOVARS OF THE MAIN SUBSPECIES OF YERSINIA PESTIS

K A Nikiforov,G A Eroshenko,D V Utkin,L M Kukleva

doi:10.21055/0370-1069-2017-2-32-35

Abstract

Objective of the study is to design the DNA-microarray for differentiation of Y. pestis strains of the main and non-main subspecies and biovars of the main subspecies. Materials and methods. Efficiency analysis for the devised means was conducted using 62 Y. pestis strains of various subspecies and biovars, isolated in the natural foci of Russia and neighboring countries. Results and conclusions. Selected have been the DNA-targets, probes and primers – calculated. Enhanced is the method of sub-specific and biovar differentiation of Y. pestis strains by means of DNA-microarray. DNA-chip with “Med24”, “glpD(-93)”, and “45” targets allows for prompt differentiation of the strains of the main and non-main subspecies and biovars of the main subspecies based on the presence and absence of fluorescent signal by the specific for the main subspecies and its biovars DNA-targets.

Highlights

Цель исследования: разработка ДНК-чипа для дифференциации штаммов Y. pestis основного и неосновных подвидов и биоваров основного подвида
Objective of the study is to design the DNA-microarray for differentiation of Y. pestis strains of the main and non-main subspecies and biovars of the main subspecies
Efficiency analysis for the devised means was conducted using 62 Y. pestis strains of various subspecies and biovars, isolated in the natural foci of Russia and neighboring countries

Summary

Материалы и методы

В работе использовано 42 штамма Y. pestis основного подвида и 20 – неосновных подвидов, выделенных в природных очагах России, ближнем и дальнем зарубежье. Таблица 1 ДНК-мишени, последовательности праймеров и зондов для дифференциации штаммов Y. pestis основного и неосновных подвидов, биоваров основного подвида методом ДНК-чипа. Получение образцов штаммов Y. pestis для анализа в ДНК-чипах проводили методом амплификации в ПЦР выбранных ДНК-мишеней. Блокирование проводили при температуре 42 °С в течение 30 мин с использованием термошейкера при скорости вращения платформы 250 об./мин. Затем слайды отмывали при температуре 42 °С в течение 5 мин 0,1х раствором SSPE-буфера с 0,2 % SDS при скорости вращения платформы 250 об./мин. На этапе гибридизации в ячейки гибридизационной камеры вносили 80 мкл прогретой при 95 °С в течение 5 мин гибридизационной смеси, включающей 10 мкл амплификата и 70 мкл буфера для гибридизации (63 мкл 20х SSPE-буфер, 7 мкл формамида). Потом содержимое ячеек с помощью вакуумного медицинского отсасывателя отбирали, а слайды отмывали 2х раствором SSPE-буфера при температуре 42 °С в течение 2 мин при скорости 250 об./мин, затем 0,1х раствором SSPE-буфера с добавлением 0,2 % SDS. Реакцию учитывали при отрицательном результате в лунке с отрицательным контролем (гибридизационный буфер)

Результаты и обсуждение

Основной подвид античный биовар

СПИСОК ЛИТЕРАТУРЫ